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clonazione del DNA - Coggle Diagram
clonazione del DNA
Selezione e screening delle cellule trasformate
Non tutti i batteri prendono il plasmide, quindi bisogna selezionare quelli giusti.
Si usa un gene di resistenza a un antibiotico presente nel plasmide:
Si mettono i batteri su un terreno con antibiotico.
Solo quelli che hanno il plasmide ricombinante sopravvivono.
Isolamento del DNA di interesse
Si preleva il DNA contenente il gene che vogliamo clonare
Preparazione del vettore
Si usa un enzima di restrizione per
aprire il plasmide in un punto specifico, creando un sito di inserzione.
Inserimento dell'inserto nel vettore
Il frammento di DNA viene unito al plasmide con DNA ligasi
formando il DNA ricombinante
(dna ligasi è
un enzima che catalizza la formazione di legami fosfodiesterici
tra i frammenti di DNA, chiudendo il plasmide ricombinante).
Trasformazione nelle cellule ospiti
Il plasmide ricombinante viene inserito nei batteri competenti
(solitamente E. coli)
Shock termico:
si scalda rapidamente per rendere le membrane batteriche più permeabili.
Elettroporazione:
si applicano impulsi elettrici per creare pori nella membrana.