Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
NGS ...., Polymerázová řetězová reakce (PCR), Sangerovo sekvenování,…
NGS ....
NGS označuje moderní vysoce výkonné sekvenování DNA a RNA, které umožňuje paralelní čtení milionů fragmentů DNA v jednom běhu. Oproti tradičnímu Sangerovu sekvenování je NGS rychlejší, efektivnější a levnější na rozsáhlé analýzy genomů.
-
-
-
-
-
-
-
PacBio
Detekce DNA sekvence – Dlouhé čtení umožňuje detekci variant jako strukturální varianty, epigenetické modifikace a mutace.
✔ Dlouhá čtení (až 100 kb, typicky 10–30 kb)
-
-
-
-
Pacific Biosciences (PacBio) vyvinula Single Molecule Real-Time (SMRT) sekvenování, které využívá real-time pozorování polymerázové reakce.
-
-
Sangerovo sekvenování
-
DNA polymeráza prodlužuje řetězec DNA, dokud není náhodně začleněn dideoxynukleotid (ddNTP), který ukončí syntézu.
-
-
-
-
-
-
-
Illumina technologie je dominantní metodou v NGS a funguje na principu reverzibilních terminátorů a bridge amplification:
Příprava knihovny – DNA se rozštěpí na krátké fragmenty (přibližně 200–600 bp) a adaptory se připojí na oba konce.
Amplifikace na flow cell (bridge PCR) – DNA fragmenty se připojí k povrchu flow cell, kde dochází k amplifikaci pomocí bridge PCR. To vytvoří shluky identických molekul DNA.
Sekvenování pomocí reverzibilních terminátorů – Každá báze je značená fluorescenčním barvivem, které je detekováno kamerou. Terminátor se po každém cyklu odstraní, aby umožnil pokračování syntézy.
-
-
-
Sekvenování v ZMW (Zero-Mode Waveguide) – Polymeráza inkorporuje fluorescenčně značené nukleotidy v reálném čase a kamera zaznamenává fluorescenční signály.