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TECNICHE DI FARMACOLOGIA 3 - Coggle Diagram
TECNICHE DI FARMACOLOGIA 3
APPLICAZIONI DEL DNA AMPLIFICATO
•IL DNA PURIFICATO E AMPLIFICATO PUÒ ESSERE UTILIZZATO X :
-CLONAGGIO
-DIAGNOSI MOLECOLARE
-SEQUENZIAMENTO
STERILITÀ E PREVENZIONE DELLA CONTAMINAZIONE
•ESSENZIALE X EVITARE RISULTATI FALSATI:
-
EVITARE CONTAMINAZIONI CROCIATE
CAMBIANDO PUNTALI FREQUENTEMENTE.
-
LAVORARE IN CAPPA STERILE
CON GUANTI E MATERIALI STERILI.
-
SEPARARE LE AREE DI LABORATORIO
(ESTRAZIONE DNA ≠ AMPLIFICAZIONE).
•SEGNALI DI CONTAMINAZIONE:
-
BANDE ANOMALE NEL GEL DI AGAROSIO
→ PRESENZA DI DNA ESTRANEO O PRIMER DIMERIZZATI.
QUANTIFICAZIONE DEL DNA
•IMPORTANTE X DETERMINARE LA QUANTITÀ CARICATA NELLA PCR.
•
METODI COMUNI
:
-
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
(CON BROMURO DI ETIDIO E MARKER DI PESO MOLECOLARE).
-
GEL DI POLIACRILAMIDE
X FRAMMENTI + PICCOLI.
PCR: AMPLIFICAZIONE DEL DNA
•
FASI DELLA PCR
:
2.
ANNEALING
(52-55°C) → ATTACCO DEI PRIMER ALLE SEQUENZE BERSAGLIO.
3.
ESTENSIONE
(72°C) → SINTESI DEL NUOVO FILAMENTO CON
TAQ POLIMERASI
.
1.
DENATURAZIONE
(95-98°C) → SEPARAZIONE DEI 2 FILAMENTI DI DNA.
•IL NUM DI CICLI DIPENDE DAL DNA TARGET E DALL’ESPERIENZA DELL’OPERATORE.
•TECNICA X OTTENERE COPIE MULTIPLE DI DNA PARTENDO DA QUANTITÀ MINIME.
ESTRAZIONE DEL DNA
FASI:
5.
RACCOLTA E RISOSPENSIONE
IN SOLUZIONE FISIOLOGICA.
3.
PURIFICAZIONE
CON ENZIMI (PROTEASI, RIBONUCLEASI) E REAGENTI (SDS, PROTEINASI K).
2.
SEPARAZIONE DEI GLOBULI BIANCHI
DAGLI ERITROCITI TRAMITE CENTRIFUGAZIONE E UTILIZZO DEL
BUFFER DI LISI
.
4.
STABILIZZAZIONE E PRECIPITAZIONE
CON CLOROFORMIO ED ETANOLO.
1.
PRELIEVO DEL CAMPIONE
(ES. 1,5 ML DI SANGUE).
•PUNTO DI PARTENZA: CELLULE UMANE, VIRUS, BATTERI, TESSUTI, SANGUE.