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TÉCNICAS BÁSICAS EN CULTIVOS - Coggle Diagram
TÉCNICAS BÁSICAS EN CULTIVOS
CAMBIO DE MEDIO
objetivos: renovar los nutrientes y evitar acumulación de productos metabólicos tóxico o de células muertas
factores que indican necesidad de cambio: PH,(amarillo: bacterias o muchas cel y rojo: hongos)
Frecuencia flexible: densidad celular alta, color del medio, cultivo baja densidad
procedimeinto: calentar el medio a 37C/retiar el medio y añadir nuevo
medio de mantenimiento: para mantener el metabolismo más lento --> medio convencional con - 2% suero, medios libres de suero
CICLO DE CRECIMIENTO
Pases rutinarios llevan a la repetición de un ciclo de crecimeinto estandar
MULTIPLICACIÓN
inhibición de la división por contacto
diferenciación celular provocada por los contactos intercelulares
acumulación de células apoptóticas o necróticas
agotamiento de los nutrientes
células en continua división crecen hasta ocupar toda área o volumen
RECUENTO CELULAR
Recuento con hemocitómetro(cámara de neubauer)
Ventajas: coste y visualización de células
Limitaciones: proceso lento y subjetivo
DEF: portaobjetos modificado para calcular la concentraciones de células, adaptada al microscopio de campo claro o contraste de fases
Recuento con contador automático (luna)
Ventajas: altas densidades celulares, rápido, eficaz y queda registrado
Limitaciones: coste
Modelo: recuento automático visual o basados en la impedancia
basado en la impedancia: las células pasan por orificio, las oscilaciones de resistencia son detectadas, amplificadas y registradas. Una vez determinada la concentración celular: añadir medio para ajustar la concentración requerida
SPLIT RATIO
Medida para siembras
se elige para
ciclo de crecimiento estandar
no entren en meseta antes del subcultivo
densidad óptima para entrar en fase Log en menos de 24 h
CRIOCONSERVACIÓN
Medio de congelacion (crioprotectores + SFB)(también podría hacerse con medio)
crioprotectores: glicerol o DMSO*
Velocidad de congelación: congelación lenta y luego tranferir a tanque de N
Descongelación: rápido, diluyendo en medio fresco
DEF: proceso por el que las células son congeladas a bajas temperaturas, para mantener las características morfológicas y fisiológicas
Consideraciones para una buena congelación
menor temperatura posible:minimizar efectos de altas concentraciones de soluto
descongelación rápida: menos cristales y gradiente de soluto
crioprotectores: para coger agua
congelación lenta :evita cristales
SUBCULTIVO
SUBCULTIVO DE CÉLULAS ADHERENTES
Disgregación mecánica
apto para todo tipo celulares
por medio de instrumento(raspador o bisturí) o sacudiendo la placa
hay clasters
se conservan uniones celulares*
no es homogénea
Disgregación química
uso de agentes que disocian células por emplazamiento con cationes divalentes, que establizan uniones intracelulares
Unión entre MEC-célula por proteínas transmembrana calcio dependientes
2 métodos : lavado celular con soluciones sin iones divalentes(sin Ca ni Mg) / soluciones con quelantes EDTA
Disgregación enzimática
uso de proteasas que dirigen las proteínas celulares implicadas en la adhesión celular
Proteasas + utilizadas
Tripsina: gran variedad de células/sola o con quelantes de calcio/eliminan SFB de las células/ neutralizan SFB/ contacto largo --> muerte/ no hay clasters
Pronasa: despegue monocapa-eficiente
Colagenasa: útil células tejido conectivo
SUBCULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN
No requieren proteasas
Ni reemplazo total del medio --> dilución