Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
LABORATORIO PROFESSIONALE 9 - Coggle Diagram
LABORATORIO PROFESSIONALE 9
METODO ETEROGENEO NON COMPETITIVO
LA CURVA HA DEI PARAMETRI CHE DEFINISCONO LE CARATTERISTICHE DEL METODO STESSO E CHE SONO:
L’INTERVALLO DINAMICO È QUELLA PARTE DI CURVA IN CUI ABBIAMO, X OGNI VARIAZIONE DI CONCENTRAZIONE, UNA VARIAZIONE DI SEGNALE QUINDI È LA PARTE CENTRALE DELLA CURVA;
IL LIMITE DI RIVELAZIONE CHE È LA DOSE + BASSA CHE SI RIESCE A RILEVARE CON QUEL METODO;
LA SENSIBILITÀ DATA DALLA PENDENZA DELLA CURVA INFATTI SE UNA CURVA HA UNA PENDENZA IMPORTANTE SIGNIFICA CHE È + SENSIBILE RISPETTO A UNA CHE HA UNA PENDENZA MINORE.
AGGIUNGIAMO IL TRACCIANTE E IL LEGAME DELLA PALLINA ROSSA SULL’ANTICORPO FA SÌ CHE LA MOLECOLA LASCI ESPOSTO UN SECONDO EPITOPO CHE VIENE RICONOSCIUTO DAL REAGENTE MARCATO
AGGIUNGIAMO IL SUBSTRATO, L’ENZIMA VA AD AGIRE SUL SUO CORRISPONDENTE SUBSTRATO
ED EMETTE UN SEGNALE LUMINOSO O FLUORESCENTE.
(SEGNALE È DIR PROP ALLA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA)
DOPO L’INCUBAZIONE, RESTANO ATTACCATE AGLI ANTICORPI SOLO LE MOLECOLE DI CUI SI È FORMATO IL SANDWICH.
LE MOLECOLE DI TRACCIANTE, DI ENZIMA SONO DIR. PROP. ALL’ANALITA CHE È PRESENTE,
NON C’È UNA COMPETIZIONE MA C’È UN’ASSOCIAZIONE TRA LE MOLECOLE.
NEL TUBO DI REAZIONE AGGIUNGIAMO IL CAMPIONE
QUINDI LE MOLECOLE DI CAMPIONE TENDERANNO A PORTARSI VERSO L’ANTICORPO
ABBIAMO LA FASE SOLIDA SEMPRE CON GLI ANTICORPI DI CATTURA,
NEL METODO A SANDWICH ABBIAMO UNA CURVA CHE È DIRETTAMENTE PROPORZIONALE QUINDI SE AUMENTA LA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA AUMENTA IL SEGNALE;
ABBIAMO UN ANDAMENTO SIGMOIDALE DOVUTO ALLA SATURAZIONE DELL’ENZIMA E ALLA SPECIFICITÀ NELLE DOSI DELLA CONCENTRAZIONE BASSA;
LA CURVA HA UN ANDAMENTO DIFFERENTE PERCHÉ È A SALIRE.
SI VIENE A FORMARE UN COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO, UNA SORTA DI SANDWICH IN CUI SI LEGANO TUTTE E 3 LE MOLECOLE CONTEMPORANEAMENTE.
ANTIGENE
RAPPRESENTATO DALL'ANALITA CHE ABBIAMO NEL CAMPIONE (EZ FT3)
UN
2° ANTICORPO
CHE LEGA TUTTO IL COMPLESSO. (TRACCIANTE)
ANTICORPO
INDIRETTO
PREVEDE L’INTERVENTO DI UN SECONDO ULTERIORE ANTICORPO
DIRETTO
SI FORMA DIRETTAMENTE IL SANDWICH SULL’ANALITA
METODO OMOGENEO NON COMPETITIVO
LA CURVA VIENE PRODOTTA RAPPRESENTANDO IL SEGNALE OTTENUTO X CIASCUN STANDARD IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITA NELLO STANDARD.
LA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA NEL CAMPIONE VIENE DETERMINATA PER INTERPOLAZIONE SU UNA CURVA DOSE-RISPOSTA PRODOTTA IN PARALLELO UTILIZZANDO DEGLI STANDARD.
IN REALTÀ LA CURVA DOSE-RISPOSTA PUÒ PRESENTARE:
UNA CURVATURA A DOSI BASSE DI ANALITA A CAUSA DI UN LEGAME ASPECIFICO
ED UNA CURVATURA A DOSI ALTE A CAUSA DELLA SATURAZIONE DELL’ANTICORPO DI CATTURA O RIVELAZIONE.
SOLO QUANDO I 2 ANTICORPI SONO LEGATI ALL’ANTIGENE
GLI ENZIMI SONO SUFFICIENTEMENTE VICINI X OTTENERE QUANTITÀ MISURABILI CON 2 SUBUNITÀ DELLO STESSO ENZIMA,
CON UN DONATORE ED UN ACCETTORE DI UNA COPPIA FRET (FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRASFER).
LA CURVA IDEALE È LINEARE
2 ANTICORPI MONOCLONALI DIRETTI CONTRO DIVERSI EPITOPI DELL’ANTIGENE VENGONO MARCATI CON 2 ENZIMI SCELTI
IN MODO CHE IL PRODOTTO DELLA REAZIONE CATALIZZATA DEL 1° SIA IL SUBSTRATO PER IL 2° (GLUCOSIO OSSIDASI E PEROSSIDASI).
METODO ANALITICO ENZIMATICO DIRETTO
A QUESTO PUNTO AGGIUNGIAMO IL SUBSTRATO,
IN FUNZIONE DI QUANTE MOLECOLE DI TRACCIANTE SONO PRESENTI QUESTO SUBSTRATO VERRÀ CONSUMATO O COMUNQUE UTILIZZATO DALL’ENZIMA;
L’AGGIUNTA DI SUBSTRATO PORTERÀ ALLA DETERMINAZIONE DEL SEGNALE
DOPO OPPORTUNA INCUBAZIONE, CI RITROVEREMO A LAVARE TUTTO QUELLO CHE NON HA REAGITO CON GLI ANTICORPI
E CI RITROVEREMO IN UNA SITUAZIONE IN CUI NEL TUBO, DOVE C’ERANO GLI ANTICORPI, CI SARANNO ATTACCATE DELLE MOLECOLE DI ANTIGENE O PRESENTE NEL CAMPIONE O MARCATO DI REAGENTE.
CONTEMPORANEAMENTE AGGIUNGIAMO IL TRACCIANTE
NELLA PARTE INIZIALE E FINALE LA CURVA È PIATTA
PERCHÉ NELLA PARTE FINALE SIGNIFICA CHE QUANDO SI HA UNA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA MOLTO ELEVATA, A UN CERTO PUNTO, SI HA UNA SATURAZIONE DEI SITI ANTICORPALI PER CUI IL REAGENTE TRACCIANTE NON SI LEGA COMPLETAMENTE
NELLA PARTE BASSA DELLA CURVA, SE LA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA È MOLTO BASSA, SI AVRÀ QUASI ESCLUSIVAMENTE LEGATO AL REAGENTE IL TRACCIANTE E ANALITA NO
E QUINDI NON SI RIESCONO A DISTINGUERE PICCOLE VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE PERCHÉ TUTTI I SITI SARANNO OCCUPATI DALL’ANTIGENE MARCATO.
LA VERA CURVA CHE VIENE UTILIZZATA, SU CUI SI VANNO A RIPORTARE TUTTE LE LETTURE DI TUTTI I CAMPIONI X RISALIRE ALLA CONCENTRAZIONE, HA UN
ANDAMENTO SIGMOIDALE
IN CUI LA PARTE DI CURVA IN CUI C’È LA MAGGIORE PENDENZA È QUELLA CHE VIENE DEFINITA
RANGE DINAMICO DELLA CURVA
OVVERO X OGNI PICCOLA VARIAZIONE DI CONCENTRAZIONE ABBIAMO UN SEGNALE DIFFERENTE;
NELLA 1° FASE AGGIUNGIAMO, NEL TUBO COATTATO, IL CAMPIONE
I COMPONENTI DELLA REAZIONE SONO:
DAL TUBO DOVE FISICAMENTE AVVIENE LA REAZIONE,
L’ANTIGENE (TSH),
FASE SOLIDA RAPPRESENTATA DAI TUBI COATTATI, DOVE E' PRESENTE L'ANTICORPO ADESO
IL TRACCIANTE CHE È SEMPRE UNA MOLECOLA DI TSH LEGATA ALL’ENZIMA,
IN SOLUZIONE ABBIAMO ANCHE IL SUBSTRATO ENZIMATICO SPECIFICO PER QUELL’ENZIMA.
IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA DA CERCARE SI REALIZZERANNO + O - LEGAMI CON GLI ANTICORPI
ALCUNI ANTICORPI SARANNO ADESI CON L’ANALITA
E
ALCUNI CON L’ANALITA TRACCIATO.
INTERFERENZE
QUESTI METODI SONO SOGGETTI A INTERFERENZE:
LA PRESENZA NEL CAMPIONE DI MOLECOLE CHE DANNO REAZIONE CROCIATA CON L’ANTICORPO
O CHE INTERFERISCONO CON LA FORMAZIONE DEL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO
O CHE COMPETONO CON L’ANTICORPO PER IL LEGAME CON L’ANTIGENE;
VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
PICCOLI VOLUMI DI CAMPIONE,
PICCOLI VOLUMI DI REAGENTI,
DIAGNOSI PRECOCE E DETERMINAZIONE DI SOSTANZE IN TRACCE.
POSSIBILITÀ DI AUTOMAZIONE:
DISPONIBILITÀ DI DISPENSORI, LAVATORI, LETTORI ED ELABORATORI DEL SEGNALE AUTOMATICI;
+PRECISIONE E ACCURATEZZA;
ANALISI DI NUMEROSI CAMPIONI NELLA STESSA SEDUTA ANALITICA
RAPIDITÀ DI ESECUZIONE;
ANALISI DI NUMEROSI CAMPIONI PER GIORNO.
ELEVATA SPECIFICITÀ DI RICONOSCIMENTO TRA AG E AB (CAMPIONI FLUIDI E SOLIDI);