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LABORATORIO PROFESSIONALE 8 - Coggle Diagram
LABORATORIO PROFESSIONALE 8
COSA SUCCEDE QUANDO L'ENZIMA SI TROVA A CONTATTO CON IL SUBSTRATO IN:
FLUORESCENZA
QUANDO RITORNANO ALLO STATO FONDAMENTALE EMETTENDO L’ENERGIA IN ECCESSO SOTTO FORMA DI FOTONI.
NELLA FLUORESCENZA, LE MOLECOLE ECCITATE DALLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA.
LA STESSA COSA AVVIENE IN FLUORESCENZA,
DOVE PERÒ ANDREMO A LEGGERE LA EMISSIONE DI FLUORESCENZA.
CHEMILUMINESCENZA
SICCOME LE REAZIONI DI OSSIDAZIONE CON L’OSSIGENO MOLECOLARE SONO MOLTO ESOERGONICHE, ESSE SONO FRA LE REAZIONI CHEMILUMINESCENTI + COMUNI.
LA CESSIONE DI ELETTRONI DETERMINA EMISSIONE DI LUMINESCENZE
INDICA IL FENOMENO DI CONVERSIONE DI ENERGIA CHIMICA IN RADIAZIONE LUMINOSA,
DI LUNGHEZZA D’ONDA VARIABILE DALL’ULTRAVIOLETTO ALL’INFRAROSSO COMPRENDENDO TUTTO IL CAMPO VISIBILE.
2 MOLECOLE, CHE DETERMINANO UNA REAZIONE CHIMICA, PORTANO ALLA FORMAZIONE DI PRODOTTI CHE SI RITROVANO A UNO STATO ECCITATO DI ELETTRONI
FOTOMETRIA
IN FOTOMETRIA UTILIZZIAMO LA
FENILENDIAMMINA
COME SUBSTRATO, LA PEROSSIDASI COME ENZIMA,
LA PEROSSIDASI TRASFORMA LA FENILENDIAMMINA IN 2,3-DIAMMINOFENAZINA (DAP) CHE È UNA SOLUZIONE ARANCIONE E SI PUO' REGISTRARE L'INTENSITA' DELLA COLORAZIONE ARANCIONE
QUINDI, + È INTENSA LA COLORAZIONE DELLA SOLUZIONE E MAGGIORE È LA CONCENTRAZIONE DEL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO
SI È FORMATO IL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO, IN QUESTO COMPLESSO È PRESENTE L’ENZIMA PERCHÉ È ATTACCATO AL REAGENTE;
SE ISOLIAMO QUESTO COMPLESSO E POI AGGIUNGIAMO IL SUBSTRATO CORRISPONDENTE, L’ENZIMA AGISCE SUL SUBSTRATO TRASFORMANDOLO IN PRODOTTO
IL QUALE, NELLA FOTOMETRIA, CAMBIA DI COLORE E CI DÀ UN’ASSORBANZA DELLA LUCE NEL CAMPO VISIBILE
METODI:
ETEROGENEI
QUESTO METODO NECESSITA DI UNA SEPARAZIONE DELLA FRAZIONE LIBERA DA QUELLA LEGATA PRIMA DELLA MISURA;
IL METODO DI RIVELAZIONE NON PERMETTE DI DISTINGUERE TRA:
TRACCIANTE LEGATO ALL’ANTICORPO E TRACCIANTE LIBERO.
IN ALTERNATIVA SI PUÒ PROCEDERE MEDIANTE PRECIPITAZIONE DEL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO UTILIZZANDO
GLICOLE POLIETILENICO O UN SECONDO ANTICORPO IN ECCESSO.
È IL DOSAGGIO CHE FACCIAMO UTILIZZANDO I TUBI COATTATI PERCHÉ HANNO UN SUPPORTO SOLIDO SU CUI FAR ADERIRE IL COMPLESSO,
NON COMPETITIVI
IL SEGNALE ANALITICO È DIR. PROP. ALLA CONCENTRAZIONE DI ANALITA NEL CAMPIONE
E LA CURVA DOSE-RISPOSTA È LINEARE.
TUTTO L’ANALITA PRESENTE NEL CAMPIONE VIENE CATTURATO DALL’ANTICORPO IN ECCESSO E RIVELATO;
COMPETITIVI
I 2 ANTIGENI SONO
1 PRESENTE NEL CAMPIONE E L’ALTRO PRESENTE NEL REAGENTE.
LA REAZIONE COMPETITIVA FA SÌ CHE IL SEGNALE SIA INV. PROP. ALLA CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA
PERCHÉ SE HO POCHE MOLECOLE DI ANALITA SI LEGANO MOLTE MOLECOLE DI REAGENTE E VICEVERSA.
SI BASA SULLA COMPETIZIONE PER I SITI ANTICORPALI DI 2 ANTIGENI CHE HANNO LA STESSA NATURA
LA CURVA È SIGMOIDALE
I METODI VENGONO CLASSIFICATI IN:
COMPETITIVI
,
NON COMPETITIVI
,
OMOGENEI
ED
ETEROGENEI
.
OMOGENEI
PUÒ ESSERE ANCHE PIÙ FACILMENTE AUTOMATIZZATO
RISULTA ESSERE + RAPIDO
QUESTO METODO NON NECESSITA DELLA SEPARAZIONE DELLA FRAZIONE LIBERA DA QUELLA LEGATA E QUINDI È ESEGUITO IN FASE LIQUIDA.
LA REAZIONE È DIRETTA IN SOLUZIONE ANTIGENE-ANTICORPO.