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LABORATORIO PROFESSIONALE 7 - Coggle Diagram
LABORATORIO PROFESSIONALE 7
IL TRACCIANTE UTILIZZATO
TRA LE MOLECOLE CHE POSSONO ESSERE UTILIZZATE COME TRACCIANTE ABBIAMO: ENZIMA, RADIOISOTOPO, SUBSTRATO ENZIMATICO, MOLECOLA FLUORESCENTE, COENZIMA O INIBITORE ENZIMATICO.
QUESTO PERMETTE DI OTTENERE UN SEGNALE ALTAMENTE RILEVABILE ANCHE IN PRESENZA DI PICCOLE QUANTITÀ DI TRACCIANTE,
QUINDI, DI FAR AVVENIRE LA COMPETIZIONE IN PRESENZA DI POCHE MOLECOLE ABBASSANDO IL LIMITE DI RIVELAZIONE DEL METODO.
LA SCELTA DEL TRACCIANTE CI INDIRIZZA SU METODI DIVERSI, ABBIAMO:
TRACCIANTE ENZIMATICO
CHE IN PRESENZA DEL SUO SPECIFICO SUBSTRATO PORTA ALLA FORMAZIONE DI PRODOTTI CHE POSSONO ESSERE LETTI CON LA FOTOMETRIA, LUMINESCENZA O CON LA FLUORESCENZA.
REAZIONE FLUORESCENTE
IN CUI SI UTILIZZA COME TRACCIANTE UN FLUOROFORO CHE IN PRESENZA DI UN DETERMINATO SUBSTRATO EMETTE FLUORESCENZA IN QUANTO FA CAMBIARE LA STRUTTURA CHIMICA A QUELLA MOLECOLA EMETTENDO FLUORESCENZA;
REAZIONE CHEMILUMINESCENTE
QUINDI UNA REAZIONE CHIMICA CHE PORTA AD UNA SECONDA REAZIONE LUMINESCENTE E POSSIAMO LEGGERE UN SEGNALE IN LUMINESCENZA
METODI RADIOIMMUNOLOGICI
QUANDO IL TRACCIANTE È UN RADIOISOTOPO CHE EMETTE RAGGI GAMMA CHE POSSONO ESSERE RILEVATI CON UN LETTORE DI RAGGI GAMMA;
DEVE ESSERE UNA MOLECOLA CHE HA UN ELEVATO RAPPORTO SEGNALE/MASSA,
ATTIVITA' ENZIMATICA
LA MISURA DEL PRODOTTO DELLA REAZIONE ENZIMATICA È PROPORZIONALE ALLA CONCENTRAZIONE DELL’ENZIMA
L’USO DEI SUBSTRATI FLUORESCENTI O LUMINESCENTI PERMETTE DI RIDURRE IL LIMITE DI RIVELAZIONE DEL METODO.
LA MISURA DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA VIENE COMUNEMENTE EFFETTUATA UTILIZZANDO UN SUBSTRATO CHE VIENE TRASFORMATO DALL’ENZIMA IN PRODOTTO COLORATO,
IL QUALE VIENE POI MISURATO TRAMITE FOTOMETRIA.
SI PUO' SCEGLIERE:
DI MISURARE LA VELOCITÀ DI SCOMPARSA DEL SUBSTRATO
O QUELLA DI COMPARSA DEL PRODOTTO
(QUESTO È PREFERIBILE POICHÉ LA MISURA È + ACCURATA)
L’ATTIVITÀ ENZIMATICA DEVE ESSERE MISURATA VALUTANDO LA VELOCITÀ DELLA REAZIONE ENZIMATICA;
LA VELOCITÀ DI REAZIONE ENZIMATICA SI ESPRIME COME QUANTITÀ DI SUBSTRATO TRASFORMATO NELL’UNITÀ DI TEMPO.
ENZIMA COME TRACCIANTE
VANTAGGI
L’ENZIMA UTILIZZATO COME MARCATORE PRODUCE MOLTE MOLECOLE DI PRODOTTO PER OGNI MOLECOLA DI TRACCIANTE.
UN ENZIMA IDEALE DEVE ESSERE:
SUFFICIENTEMENTE STABILE NEL TEMPO
L’ATTIVITÀ CATALITICA DELL’ENZIMA PERMETTE DI AMPLIFICARE IL SEGNALE ANALITICO.
• POSSONO ESSERE PRODOTTI IN MANIERA ECONOMICA
• PERMETTONO DI PRODURRE DELLE TECNICHE AUTOMATIZZATE;
• UNA SOLA MOLECOLA DI ENZIMA PUÒ PRODURRE MOLTE MOLECOLE DI PRODOTTO E QUINDI IL SEGNALE È MOLTO + EVIDENTE;
SE UTILIZZIAMO UN TRACCIANTE ENZIMATICO, L’ENZIMA DEVE ESSERE STABILE NEL TEMPO E DEVE POTER CONSERVARE IL REAGENTE PER UN TEMPO + O - LUNGO,
DEVE ESSERE ATTIVO ANCHE DOPO ESSERE STATO LEGATO ALLA MOLECOLA DEL REAGENTE,
SE NOI UTILIZZASSIMO DIRETTAMENTE IL SUBSTRATO COME TRACCIANTE, AVREMO UN’UNICA MOLECOLA PER OGNI MOLECOLA DI TRACCIANTE;
SE, INVECE, UTILIZZIAMO L’ENZIMA, L’ENZIMA AGISCE SUL SUBSTRATO IN MANIERA CONTINUA PRODUCENDO UN SEGNALE MOLTO + AMPLIFICATO.
ESEMPI DI TRACCIANTI LUMINESCENTI: LUCIFERINA, FLUORESCINA, PEROSSIDASI, LUMINOLO..
L’UTILIZZO DELL’ENZIMA CI PERMETTE DI AMPLIFICARE LA REAZIONE PERCHÉ L’ENZIMA AGISCE SUL SUBSTRATO IN MANIERA AMPLIFICATA CIOÈ RIPETENDO LA SUA ATTIVITÀ.
SVANTAGGIO PRINCIPALE
INOLTRE LA REAZIONE CHIMICA PUÒ ALTERARE LA SPECIFICITÀ DELL’ENZIMA,
È LA POSSIBILITÀ CHE CI POSSONO ESSERE DEGLI INTERFERENTI CHE ALTERANO LA FUNZIONALITÀ ENZIMATICA,