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LABORATORIO PROFESSIONALE 6 - Coggle Diagram
LABORATORIO PROFESSIONALE 6
REAZIONE ANALITICA APPROF.
LA DIFFERENZA ANTICORPO POLICLONALE E MONOCLONALE
QUANDO VENGONO PRODOTTI UNA SERIE DI ANTICORPI CHE POSSONO LEGARE LA STESSA MOLECOLA SI PARLA DI
ANTICORPO POLICLONALE
IN QUANTO SONO DIRETTI VERSO LA STESSA MOLECOLA MA SU SITI DIVERSI;
INVECE, GLI
ANTICORPI MONOCLONALI
SONO MOLTO + SELETTIVI PERCHÉ SPECIFICI PER UNO SPECIFICO EPITOPO
LA PRODUZIONE SFRUTTA L’UTILIZZO DEGLI ANIMALI DA LABORATORIO PERÒ I LINFOCITI PRODUTTORI DI ANTICORPO VENGONO MISCHIATI CON DELLE CELLULE DI MIELOMA,
SI FORMANO QUESTI IBRIDOMI CHE POI POSSONO ESSERE AMPLIFICATI SIA INIETTANDOLI IN VIVO CHE FACENDO LA PROPAGAZIONE IN VITRO.
VANTAGGI:
• AUMENTA LA SPECIFICITÀ E L’AFFINITÀ X LA MOLECOLA,
• SI POSSONO UTILIZZARE ANCHE PICCOLISSIME QUANTITÀ IN QUANTO QUESTA SPECIFICITÀ FA SI CHE NELLA MOLECOLA L’AVIDITÀ SIA ANCORA MAGGIORE;
• È POSSIBILE SELEZIONARE L’ANTICORPO CON LA SPECIFICITÀ DESIDERATA;
• PUÒ ESSERE PRODOTTO IN QUANTITÀ ILLIMITATA ED È SEMPLICE DA PURIFICARE;
• SOLITAMENTE CARATTERIZZATI DA ELEVATA SPECIFICITÀ.
SVANTAGGI:
• LE TECNICHE DI PRODUZIONE SONO MOLTO + SOFISTICATE E IMPEGNATIVE ANCHE ECONOMICAMENTE;
• LA PURIFICAZIONE DI QUESTE MOLECOLE LE PORTI AD AVERE UNA BASSA AFFINITÀ;
• NON SEMPRE REAGISCONO CON LA PROTEINA;
• NON FORMANO PRECIPITATO IN SEGUITO AL LEGAME CON L’ANTIGENE;
ALCUNE MOLECOLE PRESENTANO DEGLI EPITOPI DIFFERENTI SULLA LORO SUPERFICIE PER CUI POSSONO ESSERE LEGATI DA ANTICORPI DIVERSI.
LA SCELTA DI UTILIZZARE UN ANTICORPO POLICLONALE CHE QUELLO MONOCLONALE DIPENDE DALLA MOLECOLA CHE SI VUOLE DETERMINARE:
SE È UNA MOLECOLA PRESENTE NELL’ORGANISMO A UN’ELEVATA CONCENTRAZIONE O A UNA BASSA CONCENTRAZIONE,
SE CI POSSONO ESSERE GROSSE REATTIVITÀ CIOÈ SE QUELLA MOLECOLA PUÒ REAGIRE CON ALTRE TIPOLOGIE DI ANTICORPI E FALSARE IL RISULTATO
E QUINDI IN QUEL CASO LA DITTA PRODUTTRICE SCEGLIE SE UTILIZZARE UN ANTICORPO MONOCLONALE O POLICLONALE.
LA REGIONE DI ANTIGENE CHE SI TROVA IN CONTATTO CON L’ANTICORPO È DETTA
EPITOPO
O
DETERMINANTE ANTIGENICO
.
L’ANTICORPO DI CUI SI VUOLE PRODURRE IL REAGENTE, VIENE INIETTATO IN UN ANIMALE DA LABORATORIO;
L’ANIMALE METTE IN ATTO LA SUA DIFESA IMMUNITARIA E REPLICA UNA SERIE DI ANTICORPI PER QUESTO ANALITA
IL REAGENTE VIENE PRODOTTO CON DELLE PROCEDURE DI LABORATORIO CHE SFRUTTANO L’UTILIZZO DI ANIMALI DI LABORATORIO
NELLA REAZIONE ANALITICA I REAGENTI SONO RAPPRESENTATI DAGLI ANTICORPI DIRETTI VERSO LA MOLECOLA CHE VOGLIAMO TESTARE
COME SI REALIZZA LA REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
UNA VOLTA CHE SI È FORMATO IL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO, X POTER QUANTIFICARE L’ANALITA SI DEVE INTRODURRE IL
SISTEMA DI RILEVAZIONE
,
I PRODUTTORI DI QUESTI KIT COMMERCIALI FANNO IN MODO DI RIUSCIRE A SFRUTTARE DELLE REAZIONI DOVE LA COSTANTE DI ASSOCIAZIONE È MAGGIORE RISPETTO A QUELLA DI DISSOCIAZIONE
IN QUANTO SI DEVE AVERE LA POSSIBILITÀ DI ISOLARE IL COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO E ANDARLO A MISURARE.
COSA SUCCEDE QUANDO SI METTONO IN REAZIONE QUESTI COMPONENTI?
LA
CURVA DOSE-RISPOSTA
INDICA CHE PER BASSE CONCENTRAZIONI DI ANALITA HO UN’ALTA CONCENTRAZIONE DI TRACCIANTE LEGATO,
MAN MANO CHE LA CONCENTRAZIONE DI ANALITA AUMENTA DIMINUISCE LA CONCENTRAZIONE DI TRACCIANTE LEGATO.
(SI DICE CHE QUESTA
REAZIONE È DI TIPO COMPETITIVO INVERSAMENTE PROPORZIONALE
)
NEL 1° CASO NELLA SOLUZIONE NON HO COMPLETAMENTE ANALITA E HO SOLTANTO TRACCIANTE,
IL TRACCIANTE SI VA A LEGARE A TUTTI I SITI ANTICORPALI
NEL 3° CASO ABBIAMO MOLTO + ANALITA RISPETTO AL TRACCIANTE E QUINDI, ALLA FINE, AVREMO
3 SITI ANTICORPALI LEGATI ALL’ANALITA
E
1 SOLO LEGATO CON IL TRACCIANTE
,
QUESTO PERCHÉ PER QUEL PRINCIPIO DI AVIDITÀ DELLA REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO NEL MOMENTO IN CUI C’È UNA MAGGIORE QUANTITÀ DI QUELL'ANTIGENE, L’ANTICORPO TENDE A CATTURARE L’ANTIGENE MAGGIORMENTE PRESENTE.
ABBIAMO 3 SITUAZIONI DIFFERENTI:
NEL 2° CASO ABBIAMO UN'UGUALE CONCENTRAZIONE DI ANALITA DEL CAMPIONE E REAGENTE
LE MOLECOLE DI ANTIGENE COMPETONO PER I SITI ANTICORPALI E ALLA FINE, AVREMO
2 MOLECOLE DI ANALITA LEGATO
E
2 MOLECOLE DI TRACCIANTE
QUINDI, MAN MANO CHE SI AUMENTA LA CONCENTRAZIONE DI ANALITA NEL CAMPIONE, SI LEGANO SEMPRE MENO MOLECOLE DI TRACCIANTE, DI REAGENTE MARCATO.
IN QUASI TUTTI I DOSAGGI ABBIAMO COME
REATTIVI
:
IL
TRACCIANTE
CHE È, IN QUESTO CASO, LO STESSO ANALITA CHE PRESENTA L’ENZIMA LEGATO
E UN
SUBSTRATO SOLIDO
(BARRA AZZURRA CON LE Y) CHE È UN SUPPORTO SOLIDO SU CUI AVVIENE LA REAZIONE CHE PUÒ ESSERE UN TUBO DI REAZIONE OPPURE LE MICROBIGLIE.
L’
ANALITA
QUINDI LA MOLECOLA CHE SI VUOLE DOSARE;
LA COSTANTE DI EQUILIBRIO DIPENDE
DALLA COSTANTE DI ASSOCIAZIONE E DALLA COSTANTE DI DISSOCIAZIONE;
MAGGIORE È LA COSTANTE DI DISSOCIAZIONE + L’EQUILIBRIO È SPOSTATO VERSO LA DISSOCIAZIONE DEL COMPLESSO.
MAGGIORE È LA COSTANTE DI ASSOCIAZIONE MAGGIORE SARÀ LA FORMAZIONE DEL COMPLESSO,
UNA PARTE DI MOLECOLE SI CONVERTONO IN COMPLESSO
E UNA PARTE DI COMPLESSO SI DISSOCIA.
ANTICORPO
E
ANTIGENE
, IN UNA SITUAZIONE DI EQUILIBRIO PORTANO ALLA FORMAZIONE DI QUESTO COMPLESSO ANTIGENE-ANTICORPO.