Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
KHUYÊCH ĐẠI NUCLEIC ACID - Coggle Diagram
KHUYÊCH ĐẠI NUCLEIC ACID
PCR
KHÁI NIỆM
-
PCR dựa trên cơ sở:
- Sự bắt cặp bổ sinh các mồi ở đầu 5' và 3' của DNA đích
- Sự xúc tác kéo dài chuỗ Taq polymerase trong môi trường có bổ sung các Nu pu mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase trong môi trường có bổ sung các Nu tự do để khuếch đại các acid nucleic đặc trưng.
-
NGUYÊN LÝ
- Công thức khuếch đại PCR: 2^n (n là số chu kỳ)
- Một phản ứng PCR có thể thực hiện: 25-40 chu kì
ĐIỀU KIỆN
PCR có 3 giai đoạn:
(biến tính, tổng hợp, kéo dài chuỗi)
Tổng hợp
Biến tính
Sử dụng to cao -> duy trì 2 mạch tách rời nhau, tạo điều kiện cho mồi găn vào, nhưng tgian ngắn hơn: 30s-1p
Gắn mồi
Hạ điều kiện xuống cho mồi gắn vào, với nhiệt độ tối ưu: 55-60oC
Kéo dài phân tử
kéo dài phân tử DNA, với nhiệt độ tối ưu: 70-72oC, cũng là nhiệt độ tối ưu enzyme DNA polymerase hoạt động
Hoàn chỉnh sp khuếch đại
Là gđ hoàn thiện sp PCR chưa hoàn chỉnh, nhiệt độ giai đoạn Hoàn chính sp khuếch đại= nhiệt độ giai đoạn Kéo dài phân tử của bước tổng hợp=70-72oC, thời gian kéo dài hơn 5-10p
Biến tính
- Là qtrinh sử dụng nhiệt độ cao (94-95%) để làm bung lk hydro 2 mạch xoắn kép DNA khuôn mẫu, bất hoạt sự hoạt động enzyme, tgian phụ thuộc vào dna khuôn mẫu
ƯU ĐIỂM - NHƯỢC ĐIỂM
Ưu điểm: đơn giản, độ chính xác cao, tiết kiệm được thời gian
Nhược điểm: giá thành (thiết bị, hóa chất) cao, y/c trình độ kỹ năng chuyên môn -> giá thành mẫu phân tích cao
CÁC LOẠI PCR PHỔ BIẾN
PCR tổ (Nested)
- ĐN: dựa vào việc sử dụng 2 cặp mồi để khuếch đại trình tự mục tiêu. Cặp mồi 1 (dùng để khuếch đại trình tự vòng ngoài), cặp mồi 2 (dùng để khuếch đại trình từ sp cặp mồi 1)
- Y/c mồi: Nhiệt độ mồi 1 cao hơn mồi 2 từ 8-10oC, lượng mồi 2 phải được sử dụng hết
- Ưu điểm: Tìm ra sp PCR đặc hiệu khi mồi (độ đặc hiệu thấp)
- Nhược điểm: Khả năng ngoại nhiễm khá cao (do bsung sp PCR bước 1 vào bước 2) -> Non-stop Nested PCR
PCR đảo ngược (Inverse)
- ĐN: khuếch đại phân tử DNA kế cận có trình tự đã biết trước= 2 mồi chạy ngược hướng nhau.
- Y/c: ptu DNA được cắt 2 đầu bằng enzyme cắt hạn chế 1/nhiều loại enzyme đầu lệch -> gắn 2 đầu DNA tạo thành vòng tròn.
PCR đa mồi (Multiplex)
- ĐN: dùng để khuếch đại nhiều trình tự mục tiêu của cùng 1/ nhiều tác nhân khác nhau trong 1 phản ứng PCR bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau
- Y/c mồi: Nhiệt độ bắt cặp các mồi gần như nhau, tránh bắt cặp với nhau tạo HT dimers-primer, khuếch đại sp PCR đặc hiệu có kích thước khác nhau.
PCR multiplex: có 2 loại (2 gen/2 tác nhân, 2 gen/1 tác nhân
PCR mỏ neo
- ĐN: khuếch đại phân tử DNA mở rộng trên DNA đích đã biết trước. Mồi 1 (tổng hợp theo hướng 5'-3') và đầu 3' DNA mẫu gắn chuỗi oligo (dG nhân tạo). Mồi 2 (gắn chuỗi oligo dC vào đầu 5'). Cắt đuôi (dG-dC) bằng enzyme cắt hạn chế.
-
THÀNH PHẦN
-
MgCl2
- KN: ảnh hưởng nhiệt độ biến tính DNA khuôn mẫu, quá trình ủ primer, tính đặc trưng sp PCR, hoạt tính enzyme Taq, độ chính xác kqua
- Nồng độ tối ưu: 1.5-2.5mM
- Nồng độ Mg2+ thấp: PCR k thực hiện được
- Nồng độ Mg2+ cao: làm kqua PCR nghèo đi, xh hiện tượng bắt cặp giả
Mồi
- Mồi xuôi: Nu bắt cặp bổ sung từ đầu 3'-5'
- Mồi ngược: Nu bắt cặp bổ sung từ đầu 5'-3'
- Nồng độ primer sử dụng : 0.1-0.6 μM
-> Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi: 10-20pmol/μL
- Chiều dài: 17-30 Nu
- Chọn trình tự mồi có: 50%GC
- Nhiệt độ nóng chảy Tm=4(G+C) + 2(A+T) và trừ 5°C (NĐ gắn mồi)
- HT "hair-pin" mỗi mồi sẽ kẹp xoắn tóc
-> Tránh hiện tượng bắt cặp bổ sinh 2 đầu của mồi
- HT "dimers-primer": 2 primer bắt cặp với nhau
-> Tránh G,C ở đầu 3' primer/ chọn vùng có trình tự tương đồng
Sử dụng mồi có nồng độ cao: không cần thiết, bất lợi
Sử dụng quá thừa mồi: gây HT dimer-primer và HT gắn mồi nhầm vị trí trên khuôn mẫu
dNTP
- Là nguyên liệu cho quá trình tổng hợp ptu DNA mới
- Nồng độ tối ưu: 200μM
DNA khuôn mẫu:
- Khuôn mẫu: DNA (mạch thẳng, mạch vòng, plasmid siêu xoắn, tổng số), cDNA.
- Y/c: có trình tự Nucleotid nguyên vẹn và có vị trí bám dính đặc hiệu của các mồi.
- Kích thước DNA mục tiêu khuếch đại: 200bp - 3kb.
- Lượng DNA cần dùng: hệ gen người (500 ng), DNA vi khuẩn (1-10 ng), DNA plasmid (0.1-1 ng)
Đệm phản ứng
- Cung cấp môi trường pH ổn định để đảm bảo enzyme Taq hoạt động
- Thành phần chính: Tris-HCl, KCl, gelatin
- pH tối ưu: 7-8.5
RT-PCR
Thành phần RT-PCR
= T/p PCR + Enzyme phiên mã ngược (MMLV-RT, AMV-RT)
- MMLV-RT: Moloney Murine Leukemia Virus -> UT bạch cầu ở chuột
- AMV-RT: Avian Myeloblas Tosis Virus -> UT tủy ở gia cầm
- MMLV-RT có hoạt tính RNaseH rất yếu so với AMV-RT
=> Thuận lợi tổng hợp các ptu DNA từ ptu RNA có kthuoc lớn.
- Khuôn mẫu: mRNA mang đuôi poly A hay RNA tổng số
- Mồi: mồi oligo (dT) lấy từ VSV nhân chuẩn, mồi đặc hiệu/ngẫu nhiên lấy từ vsv tiền nhân, virus.
-
KN
RT-PCR= PCR + phiên mã ngược
- là kỹ thuật dùng để khuếch đại và định lượng RNA
-> Nghiên cứu biểu hiện gen, tạo dòng, xây dựng thư viện cDNA và tổng hợp mẫu dò
Phân loại
RT-PCR 2 giai đoạn
Gồm 2 bước:
- Bước 1: phản ứng RT (RNA pma thành cDNA= enzyme pm ngược)
-> dùng enzyme RNAses-H cắt bỏ RNA bổ sung trên sợi cDNA + tăng nhiệt độ lên để phá hủy enzyme pm ngược.
- Bước 2: khuếch đại PCR (cDNA được khuếch đại PCR nhờ 1 cặp mồi đặc hiệu cho 1/nhiều gen)
- Nhược điểm: dễ ngoại nhiễm -> GP tối ưu: use dUTP và Uracil DNA-glycosilase trong quá trình cb hỗn hợp pu
RT-PCR 1 giai đoạn
Giống 2 giai đoạn, nhưng thành phần pu được cho vào cùng 1 tube trước pu (mồi tổng hợp cDNA = mồi khuếch đại DNA đích)
- Ưu điểm: tiện lợi, giảm ngoại nhiễm
- Nhược điểm: k được sử dụng để phát tín hiệu di truyền từ mẫu RNA sợi đơn.
REAL-TIME PCR
KN-đặc điểm
KN: Real-time PCR: là PCR mà kết quả khuếch đại của DNA mực tiêu được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua việc ghi nhân tín hiệu huỳnh quang phát ra trong quá trình diễn ra phản ứng
-
- Ưu điểm: Rút ngắn thời gian, hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm, độ nhạy cao hơn, định lượng các bản sao của DNA đích
- Nhược điểm: đầu tư lớn về thiết bị-hóa chất, thiết kế mồi- đầu dò đặc hiệu
- Nhược điểm Southern blot, Nothern blot: tgian phân tích kéo dài, lượng Nu ban đầu lớn
-> Ưu điểm Realtime-PCR: tgian phân tích ngắn nhất, số lượng nucleic ban đầu nhỏ nhất
-
Có 3 chức năng:
- Phát hiện sự hiện diện các trình tự DNA đích trong mẫu
- Định lượng các bản sao trình tự DNA đích
- Phân tích đường cong nóng chảy/ nhiệt độ nóng chảy
Thành phần
Gồm 7 loại: Primers, Taq polymerase, dNTP, PCR buffer, MgCl2, Target DNA (Template) và Chất phát huỳnh quang
<Mồi>:
- Tính đặc hiệu
- Chiều dài mồi: 16-28 Nu, quá ngắn (sp khuếch đại đặc hiệu thấp, khó thiết kế nhiệt độ gắn mồi tối ưu), quá dài (tăng chi phí tổng hợp mồi)
- Thành phần GC mồi: 35-65%, quá cao (kq sai số), quá thấp (lk mồi với trình tự đích kém, giảm hiệu suất PCR)
- Nhiệt độ nóng chảy mồi: tối ưu (55-65oC), Tm=4(G+C)+ 2(A+T)
- Kthuoc sp khuếch đại: hiệu quả (75-250bp), nhỏ hơn (khó pb sp khuếch đại đặc hiệu vs sp dimer-primer), dài hơn (khó đạt hiệu quả PCR)
- Hạn chế nhiễm DNA/ khuôn mẫu RNA: mồi xuôi-mồi ngược được thiết kế từ các exons khác nhau và kéo dài ranh giới giữa vùng exon-intron.
-
Probe (đoạn dò, mẫu dò)
- Là đoạn oligo-Nu sợi đơn có trình tự bắt cặp bs với 1 trình tự đặc hiệu trên ptu DNA đích.
Đặc điểm:
- Độ đặc hiệu rất cao
- Nhiệt độ nóng chảy cao hơn 8-10oC
- Tỷ lệ GC chiếm 35-65%
- Đầu 5' gắn reporter k chứa G
- Tránh ht tự gắn, hình thành cấu trúc thứ cấp -> giảm hiệu suất lai, giảm độ nhạy kqua
- Chọn trình tự đặc hiệu DNA khuôn mẫu -> tránh HT nhiễm chéo
- Mẫu dò thiết kế vị trí gần mồi ngược-mồi xuôi
- Không tgian vào quá trình khuếch đại
- Bao gồm: chất phát tín hiệu huỳnh quang
và chất hấp thụ tín hiệu huỳnh quang
- Sp k đặc hiệu, ngoại lai -> Giải pháp đặc hiệu nhất: thiết kế mồi sao cho sự bắt cặp vào trình tự DNA đích
- Dựa vào đường cong nóng chảy -> Sp PCR có đặc hiệu hay không
2 Pp phát màu huỳnh quang:
- Sử dụng chất nhuộm huỳnh quang (pp đơn giản nhất)
- Sử dụng mẫu dò có đánh dấu huỳnh quang lai với đặc hiệu sp PCR cần khuếch đại: Beacon probe, Taqman probe, Hybridization probes
Chất nhuộm huỳnh quang:
- Nguyên lý: chất nhuộm gắn 1 cách đặc hiệu và ptu DNA mạch đôi, cường độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA
- Có 2 loại chất nhuộm huỳnh quang: SYBR Green I và Ethidium bromide (EtBr)
- SYBR Green I: ưu điểm hơn EtBr màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao
- Beacon Probe: khó thiết kế mẫu dò, đặc hiệu (phát hiện SNP), dễ thực hiện multiplex 1 lúc nhiều tác nhân
- Taqman Probe: k thể phân tích đường cong nóng chảy
- Probe lai: đắt tiền (ít dùng), đặc hiệu tối đa cho việc sử dụng cùng lúc hai mẫu dò bắt cặp trình tự DNA đích, linh động trong việc thiết kế mẫu
- GĐ ử/pha tiềm tàng: là 1 đường thẳng nằm ngang
- GĐ lũy thừa: cđộ huỳnh quang tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ nhiệt
- Đường nền: là đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền
- Chu kỳ ngưỡng: là trị số xác định bằng số chu kỳ mà ở đố đường nền cắt được đường biểu diễn khuếch đại
- Chu kỳ ngưỡng (Ct) sớm hay muộn phụ thuộc vào số lượng bản sao DNA đích ban đầu.
- Đường biểu diễn chuẩn: là đường biểu diễn vẽ mồi quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản sao DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn.
- Hệ số tương quan R^2 biểu diễn sự tuyến tính giữa số lượng bản sao DNA đích với chu kỳ ngưỡng.
- Các tiệm cận 1 thì sự tuyến tính càng cao
- Bth: >=0.99
NHIỄM TRONG XN PCR
Quy định thực hành (07)
- TP phản ứng: được chia nhỏ, vừa đủ 1 lần ptich
- Khẩu trang, găng tay: thay đổi thường xuyên
- Thay micropipette hút mẫu +/ dùng đầu típ có lọc
- Dùng maxter mix khi ptich nhiều mẫu 1 lúc
- Phân tích có độ nhạy cao, thì chỉnh chu kì khuếch đại ở thấp nhất
- Vật liệu nên dùng 1 lần, dùng lại thì phải khử khuẩn, tiệt trùng
- Dùng hệ thống khép kin, hóa chất được cb ở dạng Mastermix và phân bố vào các tube PCR.
Biện pháp:
- Chiếu UV: đứt gãy DNA ngoại lai
- Xử lý bằng enzyme cắt hạn chế
- Sử dụng pp tách chiết tự động
- Kết hợp dUTP và Uracil N-glycosylase
Nguyên tắc Hạn chế nhiễm:
- Thiết lập các khu vực riêng biệt
- Thiết lập các quy trình thực hành trong PTN
Chia làm 3 khu riêng biệt: Khu cb mẫu, khu thiết lập pu, khu phân tích
- Không xử lý sp PCR trong khu cb mẫu
- Mẫu DNA,RNA không đặt trong khu vực cb thành phần pu
Giảm sát nhiểm:
- Use chứng âm: phát hiện nguy cơ nhiễm
- Ptich trình tự sp PCR, phân tích đa hình sợi đơn
Nguồn gây nhiễm: 4 nguồn (SP PCR từ các phân tích trước, DNA mẫu còn sót lại, Nhiễm chéo giữa các mẫu, DNA từ môi trường)
- SP PCR là một nguồn gây nhiễm nghiêm trọng nhất được gọi là Quá trình nhiễm chuyển tiếp -> dễ gây dương tính giả
Khắc phục hậu quả nhiễm:
- Loại bỏ hóa chất có nguy cơ nhiễm cao
- Vệ sinh-khử trùng toàn bộ PTN
- Thay thể toàn bộ vật dụng/ chuyển đổi tb phân tích
- Thiết kế mồi mới
-
-