Carlo V cercò di affermare il suo dominio anche in Italia, un paese ricco ma politicamente frammentato, composto da numerosi Stati in conflitto tra loro. La Francia ne approfittò invadendo ripetutamente il Ducato di Milano, dando inizio alle Guerre d’Italia. Nel 1515, il re di Francia Francesco I invase nuovamente il nord Italia per fermare l'espansione degli Asburgo, ma si scontrò con Carlo V.
Nel 1527, l'esercito tedesco arrivò fino a Roma e saccheggiò la città durante il celebre "Sacco di Roma", costringendo il papa Clemente VII a rifugiarsi in Castel Sant'Angelo, protetto dalle guardie svizzere. Nel 1525, nella battaglia di Pavia, Carlo V sconfisse Francesco I, facendolo prigioniero. I tedeschi, grazie all'uso di cannoni e archibugieri, armi da fuoco recentemente introdotte, riuscirono a prevalere sulla cavalleria francese.
Nonostante le sue vittorie, nel 1556 Carlo V decise di abdicare, spartendo l'impero tra suo fratello Ferdinando I e suo figlio Filippo II. La sua decisione fu motivata dal suo stato di salute, dopo 40 anni di governo, e dalla consapevolezza che l'impero era troppo vasto per essere gestito come un'unica entità. Inoltre, non aveva più il pieno sostegno del papato.
Ferdinando I ricevette il Sacro Romano Impero, comprendente Germania, Austria, Ungheria e Boemia, mentre Filippo II ottenne la Spagna, le colonie d'oltremare e i territori italiani.
Nel 1559, con la pace di Cateau-Cambrésis, terminarono le Guerre d’Italia, e gli Asburgo, in particolare Filippo II, ne uscirono rafforzati. Il Ducato di Milano passò sotto il controllo spagnolo, segnando la nascita di tre Stati distinti: Francia, Spagna e Impero germanico.