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Extraction et Purification de la Phosphatase Acide - Coggle Diagram
Extraction et Purification de la Phosphatase Acide
Préparation de l’homogénat :
Peser 6 g de blé germé.
Ajouter 10 mL d’eau distillée froide (4°C) dans un mortier.
Broyer le mélange tout en maintenant une température basse.
Laisser reposer à 4°C pendant 20 min avec agitation occasionnelle
Filtration :
Filtrer le mélange obtenu avec une gaze pour éliminer les particules solides.
Centrifugation :
Centrifuger à 10 000 g et 4°C pendant 5 min.
Récupérer le surnageant (Fraction I) et noter le volume.
Conserver une portion de cette fraction sur glace pour le dosage.
Purification Partielle :
Objectif : Augmenter la pureté de l'enzyme en éliminant les impuretés
Étapes :
Ajouter 2 mL de solution de MnCl₂ (1 M) pour 100 mL d’extrait enzymatique dans un erlenmeyer placé sur glace. Agiter.
Centrifuger à 10 000 g et 4°C pendant 5 min pour obtenir le surnageant (Fraction II).
Réhydrater le culot avec 5 mL de tampon acétate de sodium (pH 5,7) pour former la Fraction III.
Effectuer un premier fractionnement au sulfate d’ammonium :
Ajouter 54 mL de solution saturée de sulfate d’ammonium (pH 5,5 et 4°C) pour 100 mL de Fraction II, en petites quantités sur 15 min avec agitation continue.
Centrifuger (10 000 g, 4°C, 5 min). Récupérer le culot (Fraction IV).
Répéter un deuxième fractionnement au sulfate d’ammonium avec Fraction IV, suivi d’une incubation dans un bain-marie chauffé (70°C, 3 min) puis refroidi sur glace.
Obtenir la Fraction VI en dissolvant le culot final dans de l’eau froide.
Extraction :
Objectif : Obtenir un extrait enzymatique brut contenant la phosphatase acide.