Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Les outils de la génétique moléculaireTechniques ciblées - Coggle Diagram
Les outils de la génétique moléculaireTechniques ciblées
PCR
Principe : synthèse enzymatique exponentielle de multiples copies d'une séquence d'ADN (l'amplifier pour l'analyser)
Pour un segment d'ADN de qlq centaines de paires de bases
C'est la première étape de l'immense
majorité des analyses moléculaires :
En virologie moléculaire
En bactériologie moléculaire
En génétique moléculaire humaine
Méthode automatisée = thermocycleur
--> fait varier la température
--> 3 phases pour un cycle de PCR:
--> n cycle = quantité suffisante d'ADN
Dénaturation
-->
95°C
/ 30s
= dissociation des 2 brins d'ADN
(on supprime les liaisons non-covalentes
entre les 2 brins)
Désigner amorce = quelle séquence
on veut étudier
2.
Hybridation --> 50-60°C
/ 30s
= hybrider amorce sens + anti-sens
(amorces sont des oligonucléotides)
Mettre a bonne T° => les amorces peuvent s'hybrider
Un cycle = chaque brin copié =
doublement
de la séquence encadrée par les oligonucléotides
-->
amplification exponetielle
--> 2n (n = nb de cycle)
30 cycles = 1 millions de copies de séquences car environ 20 cycles seulement seront efficaces
Extension --> 72°
/ 30s
ADN polymérase allonge les amorces
5' --> 3'
amplifier un exon
Nécessite une
protéine thermostable
-->
Taq DNA polymérase
(la première découverte et la + utilisée)
Résultats
Visualisation résultat = électrophorèse sur gel d'agarose
(électrophorèse capillaire)
--> migration de l'ADN / charge électrique (/taille)
Révélation sous ultraviolets
Comparaison de la taille du produit PCR à une échelle de marqueur de taille (migration)
Exemple d'application de la PCR
En génétique moléculaire humaine
Détecter une
variation de la taille d’ADN
amplifié par rapport à la taille attendue
Détecter des
variations du nombre de copies (CNV)
de l’ADN génomique humain
= délétion ou duplication
PCR quantitative (qPCR)
= en temps réel
Principe : PCR standard mais à chaque cycle on mesure quelque chose qui va nous permettre de savoir quelle quantité d’ADN on a amplifié —> on peut suivre la PCR en temps réel
2 possibilités
1ère possibilité : incorporer un
intercalant de l’ADN fluorescent
dans le milieu
A chaque cycle on mesure la quantité de fluorescent
Courbe exponentielle
Ct = seuil de détectabilité
= nb de cycle devient positif (ex : covid)
Qt ADN = proportionnelle à celle de départ
Point final
= qt ne change pas donc non quantitatif
2eme possibilité :
utilisation d'une
sonde hydrolyse
spécifique d’une région de l’ADN que l’on veut explorer
Sonde coupée quand la polymérase la traverse (durant élongation)
--> libère un fluorochrome qui est détecté
PCR digitale en gouttelette
Principe : séparer les molécules d’ADN dans des
gouttelettes lipidiques
(micro-compartiments)
--> dans une gouttelette :
0,1 ou 0,2 molécule d’ADN
--> + tout le milieu réactionnel nécessaire pour la PCR
Etapes :
Echantillon --> division --> amplification --> quantification
PCR multiplex semi-quantitative de courts
fragments fluorescents d’ADN (QMPSF)
Amplification de
plusieurs
région d'ADN
--> plusieurs couples d'amorces fluorescentes
Arrêt de la PCR pendant la phase exponentielle (22 ou 23) --> patient témoin
Electrophorèse capillaire = séquenceur
Pic = molécules d’ADN de taille différente —> on aligne le pic d’un patient + d’un contrôle pour détecter des duplications...
=> PCR semi-quantitative + détection par fluorescence
Multiple Ligation-Dependent
Probe Amplification (MLPA)
Les amorces/oligonucléotides vont
s'hybrider
--> design amorce pour que soient côte-côte
--> amorces universelles
Réaction de ligation
: de 2 sondes pour en faire 1.
Puis réaction PCR
Electrophorèse capillaire --> séparation par la taille
Comparaison quantitative pendant phase exponentielle
Réaliser la
première étape d’amplification avant le séquençage Sanger
Application de la PCR à l'ARN
Etape de
reverse transcriptase : RT-PCR
(avant PCR)
--> amplifie l'ARNm d'un gene après transformation de l'ARNm en ADNc (complémentaire)
Amorces dans milieu réactionnel :
Amorces oligodT
: amplification des ARNm à partir de la queue polyA.
Amorces hexamères aléatoires
: amorçage à différents endroits de l’ARN.
Parfois (one-step RT PCR) :
amorces spécifiques du gène
=> réaction enzymatique dans un thermocycleur
Après RT, on dispose d’ADNc de tous les ARNm qui étaient dans l’échantillon.
L’ADNc pourra ensuite être amplifié par PCR et toutes ses applications
Risques de contamination
Extreme sensibilité de la méthode explique le risque de contamination
Précautions
sectorisation des pièces (on ne revient pas en arrière)
utilisation de réactifs stériles
pointes de pipettes avec filtres
exposition des paillasses aux UV ou nettoyage après manipulation
Séquencage Sanger
méthode de Sanger = méthode des
didesoxyribonucléotides
= séquençage de première génération (la plus utilisé pour séquencer fragment ADN
Principe : déterminer la
suite des paires de bases
d’un segment d’ADN.
La séquence des acides nucléiques
Etapes :
PCR
(nécessite l’amplification au préalable du segment d’ADN d’intérêt par PCR)
Reaction de séquencage de Sange
r
= cycles de dénaturation, hybridation, extension
Séparation des molécules selon leur taille et lecture de la fluorescence
--> le produit doit être analyser pour déterminer la séquence
—> séparation des molécules selon leur taille + on va lire la fluorescence = par électrophorèse
Fonctionnement
Basé sur la synthèse d'un brin d'ADN (PCR)
—>par une ADN polymérase thermostable
—>à partir d’une amorce sens OU antisens
—>utilisant comme matrice l’ADN qui doit être séquencé, préalablement amplifié
—>incorporant un
mélange de desoxyribonucléotides et de didesoxyribonucléotides fluorescents terminateurs
(= s’ils sont incorporés pdt la synthèse --> arrêt de la réaction)
Dans le milieu réactionnel, compétition entre des
dNTP (desoxyribonucléotides) non fluorescents
et des
ddNTP (didesoxyribonucléotides) fluorescents.
Le
dNTP permet la polimérisation
grâce à son
groupement
OH en 3’
Le ddNTP = pas de OH —> ne permet pas la polymérisation après lui + a un groupe fluorescent qui permet de le détecter
Lorsque les ddNTP s'incorporent :
la synthèse s'arrête
la molécule devient fluorescente
A la fin : mélange de molécules fluorescentes et non fluorescentes
Élongation à partir d’une amorce avec incorporation de didésoxynucléotides fluorescents (ddNTP) :
-->
synthèse de molécules d’ADN simple brin fluorescentes
Electrophorèse capillaire
on obtient un
électro-fluorogramme
Exemple de SNV
Role séquenceur : révéler la fluorescence + trier les molécules dans l’ordre
Avant : Migration fragments d'ADN sur un gel vertical de polyacrylamide
Maintenant : exitation par un laser
=> permet de trier les molécules par taille (de la plus petite à la plus grande) + détecter la fluorescence
Le séquençage Sanger permet de détecter ce type de variations + délétion / insertion
