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ADN recombinante - Coggle Diagram
ADN recombinante
Clonación
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Preparación de ADN
Insertos
De ADN
Se parte de un lisado de células nucleadas, a partir del cual se putifica el ADN, después se fragmenta con enzimas de restricción. El freagmento a clonar se debe separar o aislar del resto (por electroforesis, centrifugación, HPLC, etc).
Procedente de ARNm
Cuando se desea clonar una secuencia de un gen eucariótico se parte de muestras de ARNm que debe convertirse en ADNc. Una vez lisadas las células específicas de interés se purifica el ARNm (cromatografía de afinidad o micoresferas magnéticas). Para preparar el ADNc se emplea la trascriptasa inversa.
Descripción
Se realizan múltiples rondas de replicación catalizada por la ADN pol propia de la célula anfitriiona, el fragmento de ADN o ADNc que debe clonarse se une a otro ADN y la molecula resultante se incorpora por replicación.
Una vez detectada la presencia de ADN de interés y seleccionados los clones que lo han amplificado, y se aisla el gen o fragmentos de ADN o ADNc
Formación
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Cultivos
Suele hacerse una ptimera siembra celular sobre una placa de agar para que crezcan las colonias y una resiembra posterior de éstas en medio líquido, en la que se forman poblaciones con múltiples copias de cada célula original. Dependiendo de las propiedades del vector, el ADNr puede replicarse de forma rápida e independienre del genoma de la célula anfitriona.
Vectores
Bacteriófagos
Se pueden utilizar las propiedades de infección de los virus para crear vectores de virus modificados. El inserto se introduce de la misma manera que para los vectores plasmídicos: cortando inserto y ADN del fago con enzimas de restricción y ligando parav obtener un ARNr
Se usan bacteriofagos para clonar en bacterias, baculovirus para células de insectos y virus SV40 o retrovirus para células de mamíferos.
Cósmidos
Vectores sintéticos, quimeras que combinan características de plásmidos y fagos para tomar ventaja de ambos tipos. Los métodos de introducción dependen del tamaño den inserto; si este es pequeño se puede introducir por transformación, pero si el tamnaño es relativamente grande, se debe empaquetar previamente en forma de fago.
Plásmidos
Moléculas de ADN bicatenario, de pequeño tamaño y estructura circular cerrada, se encuentran presentes de forma libre en el citosol de numerosas bacterias y de algunos eucariontes unicelulares. Permiten la incorporación de insertos de ADN de hasta 10 kb y su modificación no afectan a la célula ya que en estos no hay genes escenciales.
Cromosomas artíficiales
Levadura
YAC. Son vectores sintéticos que contienen las tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma: se cuencias constituyentes de un centrómero, de dos telómeros y de un origen de replicación. Admiten un inserto de gran tamaño, que puede alcanzar 1Mb.
Bacteriano
BAC. Vectores sintéticos derivados de plásmido F o del fago P1. Se caracterizan por aceptar grandes insertos de ADN, entre 100 y 300 kb. Con estos se condigue mayor estabilidad de los insertos de ADN de origen eucariotico.
Detección y selección
Métodos inmunoquímicos
Detección de la proteina codificada por el gen clonado, mediante un anticuerpo específico.
Métodos genéticos
La espresión del propio inserto produce cambios apreciables en la célula anfitriona, que sirven para reflejar su clonación con éxito. La estrategia más común es la detección y selección basadas en la presencia de genes marcadires en el vector.
Método de hibridación
Detección de una secuencia de ADN clonado, o del ARNm trascrito a partir de él, por hibridación de una sonda marcada.
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