Análise genética de divergência
Método
Coleta
Várias de diferentes regiões em altitude diferentes
Etapas
Precipitação do acido nucleico com Isopropanol e lavagem com etanol 80%
A mistura das coletas foi incubado em 65C por 90 min e extração com clorofórmio/álcool
Medição da pureza do DNA genômico isolado através de espectrometria e luz UV
Eletroforese e gel de Agarose de 0,8%
Isolamento, Quantificação e Eletroforese
40 primers ISSR
Dos quais 20 foram selecionados
30 primers RAPD
Dos quais 18 foram selecionados
Para cada primer foram realizadas 25 amplificações
Carreamento do DNA com ciclo termal:
-Desnaturação a 94 C por 5 min seguida de 45 ciclos
-Desnaturação a 94 C por 1 min
-Anelamento de 1 min e 36 C pros primers RAPD e de 49-60 C para primers ISSR
-Extensões finais de 1 e 7 min a 72 C
Amplificação com PCR
Análise Estatística
Marcação dos produtos de RAPD ISSR como os que apresentam banda e os que não apresentam
Para medir a Informatividade dos marcadores
Número Total de Bandas (TB)
Percentual de bandas Polimórficas (PPB)
Número de Bandas Polimórficas (PB)
Para medir a performance dos marcadores
Conteúdo de informação polimórfica (PIC)
PICi = 2fi (1 - fi)
Índice do Marcador (MI)
MI = EMR 9 PIC
Poder de Resolução (RP)
RP = RIb
lb- fragmentos informativos
Ib = 1 - (2 9 |0.5 - pi|)
Effective Multiplex Ratio (EMR)
EMR = n.b
n - média dos números de fragmentos amplificados
b = PB/(PB + MB)
Bandas não Polimórficas (MB)
Conversão da matriz de dados dos marcadores em matriz de similaridade genética
Coeficiente de Jaccard
Distancia Genética e Similaridade
UPGMA