Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
HS 4: Scheidingsprincipes 2 - Coggle Diagram
HS 4: Scheidingsprincipes 2
Omgekeerde fase chromatografie/Reversed Phase Chromatography (RPC)
MF = meer polaire vloeistof
Elutievolgorde
polair
apolair
SF = apolaire vloeistof op een relatief inerte drager (bv.: silica met C-18)
bij HPLC en GC
toep: scheiding van gedenatureerde EW
scheidingsprincipe = interactie tss. de hydrofobe/apolaire groepen van molecule en SF
Gelfiltratie/-permeatie chromatografie (GFC, GPC, SEC)
MF = niet specifiek waterig of organisch met een veel lagere flow
Elutievolgorde
grote moleculen
kleine moleculen
SF = poreuze, onoplosbare; sterk gehydrateerde polymeren (agarose en dextraan) of polyacrylamide beads (inert)
Werkingsmechanisme
filtratie onder hoge druk
diameter molecule > diameter porie: exclusie/minimale permeatie
diameter molecule < diameter porie: permeatie/filtratie
diameter molecule << diameter porie: totale inclusie/ permeatie
toep
bepalen van de moleculaire massa van eiwitten
preparaten ontzouten mbv ammoniumsulfaat (elutievolgorde: 1.EW, 2.zout)
Scheidingsprincipe
void volume (V0) = volume buiten beads
bed volume (Vt) = volume volledig in kolom
volume ingenomen door beads (Vx) = Vt-V0
elutie volume (Ve) = volume nodig om de component 1 keer v.d. kolom te elueren
relatieve elutie volume (Ve/V0)
kenmerkend voor component, onafhankelijk van lengte kolom
grafiek p.61
Ionenuitwisselingschromatografie
Werkingsmechanisme = gebaseerd op ionaire interacties, elutie foor verandering pH/zoutgradiënt
Scheidingsprincipe
elutie met pH
kationuitwisselaar: pH laten stijgen/basisch maken => OH- veel aanwezig => EW krijgt neg lading (pH>>pI)
anionuitwisselaar: pH laten dalen/zuurder maken => H+ veel aanwezig => EW krijgt pos lading (pH<<pI)
elutie met zout (NaCl)
kationuitwisselaar: veel interactie met Na+
anionuitwisselaar: veel interactie met Cl-
gradiënt-/stapsgewijze elutie = zwakste lading laat eerst los
MF = waterig
toep.: scheiding AZ, EW, NT
SF = vaste drager
kationuitwisselaar: vangt kationen (amiogroep EW, NH3+) m.b.v. neg lading
anionuitwisselaar: vangt anionen (carboxylgroep EW, COO-) m.b.v. pos lading
Normale fase chromatografie
SF = polaire vloeistof op een relatief inerte drager
MF = meer apolaire vloeistof
elutievolgorde
apolair
polair
Hydrofobe interactie chromatografie (HIC)
Werkingsmechanisme = hoge zoutconcentratie heeft een sterke wisselwerking met de watermoleculen, waardoor er minder water beschikbaar is voor het "afschermingseffect" (laag zoutgehalte: watermoleculen ordenen zich rond hydrofobische liganden)
Scheidingsprincipe = interactie tss. de hydrofobe/apolaire groepen van molecule en SF
MF =
alleen water
zonder org solventen
zoutgradiënt en constante pH bij pI
Elutievolgorde
apolair
polair
SF = silica met korte /meer polaire R-groepen (C-4, C-2 en fenyl, minder apolair dan C-18)
Affiniteitschromatografie zie p.64-67