HS 4: Scheidingsprincipes 2

Omgekeerde fase chromatografie/Reversed Phase Chromatography (RPC)

Gelfiltratie/-permeatie chromatografie (GFC, GPC, SEC)

Ionenuitwisselingschromatografie

Normale fase chromatografie

MF = meer polaire vloeistof

Elutievolgorde

SF = apolaire vloeistof op een relatief inerte drager (bv.: silica met C-18)

  1. polair
  1. apolair

bij HPLC en GC

toep: scheiding van gedenatureerde EW

SF = polaire vloeistof op een relatief inerte drager

MF = meer apolaire vloeistof

elutievolgorde

Hydrofobe interactie chromatografie (HIC)

  1. apolair
  1. polair

Werkingsmechanisme = hoge zoutconcentratie heeft een sterke wisselwerking met de watermoleculen, waardoor er minder water beschikbaar is voor het "afschermingseffect" (laag zoutgehalte: watermoleculen ordenen zich rond hydrofobische liganden)

Scheidingsprincipe = interactie tss. de hydrofobe/apolaire groepen van molecule en SF

MF =

Elutievolgorde

SF = silica met korte /meer polaire R-groepen (C-4, C-2 en fenyl, minder apolair dan C-18)

scheidingsprincipe = interactie tss. de hydrofobe/apolaire groepen van molecule en SF

alleen water

zonder org solventen

zoutgradiënt en constante pH bij pI

  1. apolair
  1. polair

MF = niet specifiek waterig of organisch met een veel lagere flow

Elutievolgorde

SF = poreuze, onoplosbare; sterk gehydrateerde polymeren (agarose en dextraan) of polyacrylamide beads (inert)

  1. grote moleculen
  1. kleine moleculen

Werkingsmechanisme

filtratie onder hoge druk

diameter molecule > diameter porie: exclusie/minimale permeatie

diameter molecule < diameter porie: permeatie/filtratie

diameter molecule << diameter porie: totale inclusie/ permeatie

toep

Scheidingsprincipe

void volume (V0) = volume buiten beads

bed volume (Vt) = volume volledig in kolom

volume ingenomen door beads (Vx) = Vt-V0

elutie volume (Ve) = volume nodig om de component 1 keer v.d. kolom te elueren

relatieve elutie volume (Ve/V0)

kenmerkend voor component, onafhankelijk van lengte kolom

grafiek p.61

bepalen van de moleculaire massa van eiwitten

preparaten ontzouten mbv ammoniumsulfaat (elutievolgorde: 1.EW, 2.zout)

Werkingsmechanisme = gebaseerd op ionaire interacties, elutie foor verandering pH/zoutgradiënt

Scheidingsprincipe

MF = waterig

toep.: scheiding AZ, EW, NT

SF = vaste drager

Affiniteitschromatografie zie p.64-67

kationuitwisselaar: vangt kationen (amiogroep EW, NH3+) m.b.v. neg lading

anionuitwisselaar: vangt anionen (carboxylgroep EW, COO-) m.b.v. pos lading

elutie met pH

elutie met zout (NaCl)

kationuitwisselaar: pH laten stijgen/basisch maken => OH- veel aanwezig => EW krijgt neg lading (pH>>pI)

anionuitwisselaar: pH laten dalen/zuurder maken => H+ veel aanwezig => EW krijgt pos lading (pH<<pI)

gradiënt-/stapsgewijze elutie = zwakste lading laat eerst los

kationuitwisselaar: veel interactie met Na+

anionuitwisselaar: veel interactie met Cl-