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Low Cost Real-Time PCR system - Coggle Diagram

- - - - 감염병은 전세계 사망률에서 많은 비중을 차지함 .
        
        감염병은 전세계에서 25%의 사망률을 차지하는 직접적으로 관련 있는 사망원인이다.
        
        감염병 출현은 원인인자 파악을 하기 전 대규모의 감염과 사망의 높은 가능성, 질병 출현 보다 늦을 약물 개발과 승인의 시기 및 미생물의 변이, 바이러스의 내성과 진화로 인한 위협이 있다. 감염병의 억제는 1차 방어선이므로 병원체 감염자의 초기 및 조기 진단이 중요하다.
      - 진단 은 체외진단의료 기기를 통해 이루어짐
      - 검사방식 중 분자진단 기술이 많이 사용된다. (PCR)
        
        감염 질환 감지 및 식별을 위한 검사 진단은 전통적으로 배양 기반의 혈청학적 분석이 표준 방법으로 되어왔다. 하지만, 노동력과 초기 식별의 오랜 시간이 걸리는 것 대비 음성으로 나오는 문제점이 있었다.
        
        분자진단 검사법은 특이도와 재현성이 높고 민감도가 뛰어나며 검사시간이 단축되는 장점을 가지고 있다.
        
        인공적으로 유전자를 증폭하는 기술인 PCR은 소량의 DNA를 단시간에 수천 배 증폭시켜 유전자 분석을 가능하게 하는 분자진단검사방법이다. 이는 유전물질을 조작하여 실험하는 생명공학의 연구 외에 질환진단 및 범죄 수사 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 하지만, 검출에서의 여러 단계를 거쳐야 함으로 프로세스마다의 특수장비와 숙련된 전문가가 필요하다. 또한, 증폭산물을 이동시키는 과정에서 이월오염이 발생하는 문제점이 생길 수 있다.
    - - 신종 감염병의 양산
        
        한때 감염병은 예방접종 및 항생제의 개발로 선진국에서는 줄어들고 개발도상국에서의 주요 문제로 보고 있었다. 하지만, 기존 감염에 대한 의약의 발전에 불구하고 환경의 변화, 사회적 요인, 인간형태의 변화 병원체의 적응과 변화 등 여러 발생 요인으로 인해 새로운 감염과 기존감염이 재 출현 또는 새롭게 변화하여 나타나는 하는 현상이 발생하였다. 세계보건기구는 최근 신종감염병이 유례없는 속도로 증가하고 출현의 주기가 짧아지고 있다고 경고하였다. 특히, 신종감염병은 대부분 인수 공통 감염병이며 대부분 야생동물로 인하여 발생하지만, 이러한 질병에 관한 데이터는 국소화 되어있다. 인수 공통 감염은 시간이 지날수록 대규모의 전염병으로 증가된다.
      - (Covid19>전파속도,변형,경제악화)
        
        -->초기 진단 중요
        
        병원체 유발 감염병은 공중보건과 사회 경제에 영향을 준다. 인플루엔자는 특히 감염병의로 인한 사망 사유 중 비중이 제일 크다. 인플루엔자와 같이 호흡기로 통한 감염은 전염성이 높기 때문에 심각한 사회적 결과를 보여줄 수 있다. 최근 발생한 2번째 SARS변종인 covid-19 바이러스는 기존 호흡기 감염 형태의 전염성일 뿐만 아니라 물체와 표면으로도 생존하며 감염이 되는 새로운 방식으로 전염성이 높아 감염병의 확산과 치명 수준에서 제일 높은 팬데믹을 선언할 만큼 억제하기 힘들었으며 국가만이 아닌 전세계의 경제 불안정을 보여주었다.
        
        . 정확하고 빠른 병원체의 식별은 환자의 생명을 구할 수 있는 뿐만 아니라, 지역사회에서의 감염 확산을 방지할 수 있으며, 보건 관련 감염의 관리에도 필수적이다. 따라서 신속하고 정확한 검출과 분석을 하는 기술을 가진 도구는 감염과 전염병에 대응과 예방에 중요한 역할을 한다.
      - Gold standard로써 Realtime PCR [WHO]
        
        분자진단 검사법 중 실시간 PCR은 Covid-19 진단에 있어서 gold standard로 정해졌다. 전통적인 PCR에 비해서 Real-time PCR는 단순화된 공정화 검출단계에서 후처리 장치로 시료를 옮기지 않으며 DNA 융용 곡선 분석을 통해 PCR의 다중화와 통합 중첩으로 광범위한 병원체를 검출할 수 있다는 장점이 있다.
      - 검사 방식 기술에 따른 POCT기술이 대두된다.
        
        왜 POCT가 필요한지 당위성
        
        검사진단법 시간 단축과 진단능력 향상을 위한 연구는 현장검사로도 활용이 되어 가고 있다. 특히 최근 바이러스의 대규모의 팬데믹 같은 현상에 현장검사의 필요성을 상기시켜준다. 병리학의 발병은 대부분 개발 도상국의 농촌 지역에서 발생할 가능성이 높을 뿐더러 의료시설이 부족한 지역의 감염병은 사망의 문제로 지속적으로 대두되기 때문에 초기 진단과 잠재적인 확산을 방지하기 위해서 현장 진료 (point of care, POC) 어플리케이션이 제일 필요하다. 세계보건기구(WHO)에서는 이상적인 POC장치인 ‘ASSURED’을 제시하였다
        
        (ASSURED 설명 및 특징 요약할 것). 교수님 Comments
        
        poc 관련 논문 참조
        
        Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and robust, Equipment-free and Deliverable to end-users
    - - RealTime PCR
        
        Real-time PCR은 기본적으로 증폭을 위한 온도 조절기가 있는 히터/센서, 형광 검출 시스템, 컨트롤러 및 그래픽 디스플레이로 구성된다. 최근 상용화 되어있는 우수한 성능의 real-time PCR의 형광 검출 시스템은 고성능 이미지 검출기와 복잡한 구성과 다양한 광학 부품으로 결합된 고성능 형광 검출 방식으로 이루어져 있다.
      - 값비싼 증폭 및 검출 장비(광학적 거리,부가 광학계)
        
        검출을 하기 위한 이미지장치로 일반적으로는 CCD카메라, 광증배관(PMT)이나 포토다이오드를 사용한다. 또한 최대의 형광을 얻어내기 위해서 빔스플리터, 다이크로익 미러 등 부가적인 광학장치를 부가하여 검출을 개선한다. 하지만 각각의 광학적 특성으로 다양한 광학적 거리가 필요하다.
      - 크기의 한계
        
        .따라서 기존 PCR장치보다 부피와 조립의 한계 제조의 비용과 가격이 비싸 진다. 또한, 유지보수 비용이 많이 들어 환경의 제안을 받는다.
      - 응급현장, 질병진단을 위한 제반시설이 열악한 환경에 도입하기 힘들다.
        
        이는 현장진단이 필요한 자원이 제한 적인 환경인 지역에서 사용하기에는 어려우며, 이상적인 POC 장치로 되기 위한 해결해야 할 문제이다.
    - - Real-Time PCR은 광학분석 방식으로 여러 검체를 검출하기 위해서는 광학계가 복잡해질 수 밖에 없다.
        
        (appendix, 경사조명, photodiode)
        
        선 논문에 대해서 그대로 해야할지 고민
      - POCT로써 Digital PCR이 활발히 연구되고 있지만, 초기 단계이며 대량 검출이 힘들다.
        
        최근 poct로써 지속적인 기술 발전과 방법론의 개선 디지털 PCR이 개발 되고있다. 하지만, 다른 PCR 방법에 비해 처리량이 상대적으로 낮아 많은 수의 샘플을 분석하는 데 덜 효율적일 수 있다는 것. 또한 디지털 PCR은 특정 설정에서 사용이 제한될 수 있는 기존 PCR 방법보다 수행하기 기술적으로 더 어려울 수 있음. 마지막으로, 디지털 PCR은 다른 PCR 방법보다 더 비싸고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 일부 연구자 및 실험실의 접근성이 제한.
  - - - 검출기의 크기를 줄인다.
        
        상용화 되어있는 rt pcr에서 검출기로 사용하는 고가 CCD 대신 작은 크기의 검출기를 선택
        
        여기에 기존 camera ccd, cmos의 관계를 설명
        
        ccd 카메라와 단점
        
        CCD 특성상 부가 회로가 필요하고 동적 영역이 높은 대신 크기가 커지는 단점이 발생한다.
        
        디지털 카메라의 발전으로 여려기술 적용 (cmos)
        
        CMOS 센서는 제조 공정 기술만 있다면 대량생산이 가능하여 주로 스마트폰 카메라에 사용된다. 그로 인해 스마트폰 시장이 빠르게 발전함에 따라 성능이 좋은 소형 CMOS 센서를 탑재한 저가격의 카메라들이 개발되고 있다
        
        고성능의 소형 센서를 사용할 때 이점
        
        고성능의 소형 센서를 지닌 카메라는 검출 기기의 설계를 단순화하여 시스템의 비용을 줄일 수 있다. 일체형 회로로 되어있으며 센서의 크기가 작아 렌즈의 크기와 개구부도 작아 소형화가 가능하다. 또한, 소형화로 인해 신호 처리의 재현성 및 감도를 향상시키기 위한 광학적 부품들의 크기도 소형화할 수 있다. 따라서 검출 시스템의 부피가 작아지며 저가격으로 구현할 수 있어 현장진료검사(PointofCare, POC)가 가능하다
      - 논문 전체적인 목적
        
        본 논문에서는 RealtimPCR이 이상적인 poct가 되기 위해 A(Affordable)에 해당되는 저렴하고 작은 realtime pcr system을 제한한다.
        
        첫번째로 작은 시스템을 위해 realtime pcr의 한계인 광학부를 줄여야한다.
      - 프레넬:평행광 렌즈의 특징을 살려 부가적인 광학부품을 없앤다.
        
        reat time pcr 에서 프레넬렌즈의 이용 및 fresnel 기본 광학
        
        프레넬 렌즈를 사용할때 연구 시스템에서 활용될 이점
        
        EM+EX 평면에 두는 것
        
        single light
        
        다중 필터들의 하나의 모듈화
    - - 검출부의 검출기는 저가형 web camera를 채택.
      - 소형 linear step motor 채택
  - - - 4 채널 필터 휠의 구조 (EM+EX, slide tape, linear motor)
      - 저가격 소형 linear stepping motor 를 사용하여 성능 확인 (위치 오차)
    - - 카메라 성능 비교 (저가격 web, Industrial)
        
        고성능 industrial camera 장점
        
        고성능 산업용 카메라는 일반 카메라보다 좋은 성능의 부품으로 이루어져 있어 이미지 품질이 좋다. 외부 영향에 따른 유연한 조작과 렌즈의 탈착이 가능하다. 따라서 복잡하고 전문적인 측정 작업 범위에 적합하므로 형광 검출에 좋은 성능을 보여준다.
        
        저가격 web camera 장점
        
        Web 카메라는 저가격이며, 일반적인 사진 유형에 대한 모든 기능이 대부분 자동으로 설정되어 있다. 대부분 내장된 렌즈로 이루어져 있어 렌즈 교체가어렵지만, 검출 시스템에 따라 저가격으로 구현 가능하다.
      - 안정적인 형광 검출을 위한 카메라 control
    - - Fresnel lens을 사용한 간단한 광학적 구조
      - Linear stage를 구현하여 최상의 형광 검출이 가능한 위치 및 배치방법
    - - 튜브들의 균일성과 형광의 일관성을 위한 calibration 방법
      - 상용화 되어있는 기기를 통한 시스템 검증
- - - - PCR 발견 (역사)
      - PCR 단계 (변성,어닐링,연장)
      - DNA 중합효소 (PCR 반응의 구성요소)
    - - RTPCR이란:PCR에서 기술이 발전된 기법
      - RTPCR 필수요소
        
        검출화학
        
        Taq Man
        
        SYBR GREEN
        
        정량분석
        
        상대정량 : CT메서드
        
        절대정량: 표준곡선메서드
        
        multiplexing
        
        형광방출스펙트럼
    - - CAMERA
      - OPTICAL FIBER
        
        https://www.gohecho.com/fiber-optic-system-for-pcr-fluorescence-detection-01_n50
      - PHOTODIODE
      - PMT
  - - - 대표 진단 기기 system 소개
    - - Real-time polyemrase chain reaction system using an open platform camera
      - 1, thermalcycler 관련
      - Multipel compact camra fluorescence detector for real_time pcr
- - - - 구동시스템
        
        fig.시스템 블록도
        
        증폭부 관련
        
        PIC(18F4550) : 서미스터 온도 제어
        
        검출부 관련
        
        Qt Py SAMD21
        
        LED - LED driver (mpm6010 )PWM
        
        MOTOR-MOTOR drover (ld293d) linear stepper ,sensor
        
        pq12 linear actuator - 검출부 상하 움직임 tube 높이 설정
        
        ㅣ16 suvo actuator - tube 블록 움직임 heating block
        
        1, 증폭부, 검출부 controller + camera = usb2.0 to PC[local host]
      - 기구 시스템
        
        증폭부
        
        dux cycler
        
        :check: 선행연구에 쓰는거에서 더 추가를 해야하나
        
        검출부
        
        fresenel lens
        
        fresnel lens는 5x5 well 보여지는 크기인 아크릴로 되어있고 well 로 부터 10mm띄어 두었다.
        
        10mm로 둔 이유: lid heat 열이 가해지면서 기울어지는 경우 대비하여
        
        filter wheel
        
        4개 ex, em 이 하나의 모듈로 이루어짐
        
        ex 는 led 앞에 배치, em 은 카메라 앞에 배치
        
        linear stepper
        
        fresnel 에서 72mm
        
        fig. filter wheel 구조 도 자세히 (wheel fornt base , 4filter module )
        
        fig, 전체 구조 이미지
  - - - FAM, HEX. ROX. CY5 파장
      - 5dia , chtoma
    - - :check:여기다가 industrial, web을 넣어야하는지
      - web mini 298
    - - 실제 증폭
        
        dna, 시약조성
        
        protocal
      - 형광 reference
        
        FAM (0.35pmol이라 할지 750 fmol로 할지)
  - - - Back light LED, CAMERA, filter wheel 사용
      - filter wheel base에 있는 hole에 emission filter가 일치 되어 있고, 카메라 또한 emfilter wheel에 일치 되었을 때 /
        back light led를 통해 카메라에 비추어진 filter 는 원이 된다.
      - 각 필터 별 위치를 찾고 10 번 이상 motor를 사용하여 filter wheel을 이동했을 시 편차를 구한다.
    - - Industrial camera = basler , web camera=imx298
      - FAM, DDW 시약이 5X5 well로 이루어진 plate를 0, 180로 돌려 촬영 /
        이미지의 형광 밝기를 구한다.
      - 이상적인 이미지 촬영을 위한 camera setting 값 구하기(camera control)
    - - x,y stepper motor stage , filterwheel, fresnel lens
      - camera가 fresnel lens의 중앙에 배치 되어 있고 led -filter로 되어있을시
        
        camera가 fresnel lens의 중앙에 배치 되어있고 fitler-led 로 되어있을시
        
        filter-led로 두고 fresnel 중심(0,0) 에서 방사형 방향으로 camera와 함께 이동할 시
      - FAM, DDW 시약이 5X5 well로 이루어진 plate를 0, 180로 돌려 촬영 /
        이미지의 형광 밝기를 구한다.