Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Recombinant DNA Technologie - Coggle Diagram
Recombinant DNA Technologie
Inleiding
Some terminology
genetic engineering
deliberate modification of organism’s genetic information by directly changing the sequence of nucleic acids in its genome
recombinant DNA technology
procedures used to carry out genetic engineering
biotechnology
use of organisms to form useful products
Problemen
Opname vreemd DNA door gast-organisme
Stabiele integratie en/of replicatie DNA
Organismen
Bacteriën
Saccharomyces cerevisiae
(bakkersgist = eukaryoten)
Geen restrictie-enzymen, geen RecA
Restriction enzymes
bind to DNA at specific sequence called the
recognition site
cleave DNA at this site or a defined distance from it
Southern Blotting technique
Used to detect specific DNA fragments
often uses radioactive DNA
hybridization probes
autoradiography
method for detecting radioactively labeled molecules
DNA fingerprinting
Proces
Elk individu = verschillend
Knippen DNA mbv RE
Gelectroforese
Blotting
Probe
complementair met microsatelliet
Microsatellieten
Probleem
"Smeer"
4 of 5 probes die specifiek met één locus hybridiseren -> slechts 4 of 5 bandjes
Reverse transcriptase
synthesizes double stranded DNA from RNA template
used to construct complementary DNA (cDNA)
Cloning Cellular DNA Fragments
Problemen
Inbouw insert in vector
efficiëntie zeer laag!
Transformatie bacterie
efficiëntie zeer laag!
=>
Strenge selectie nodig van bacteriën met gewenste recombinant DNA (mbv selectiegenen en merkergenen op vector)
Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA
Elke vector is in het bezit van
origin of replication
een selectiegen
multicloning site (MCS) of polylinker (midden in een merkergen)
4 types van cloning vectors
Plasmids
1ste gen:
pBR-reeks
Amp en tet resistentiegenen
Ori
MCS
2de gen:
pUC
Ori => Hoog copy number
Amp resistentie
MCS
lacZ' gen
X-gal screening
Opletten!
Vals+ => witte kolonies ZONDER insert
Oorzaak: nucleases
Sluiten vector zonder insert
Oplossing: behandeling met alkalisch fosfatase
Oplossing: gebruik 2 verschillende RE
Phages and viruses
Als vectoren
Efficiënte infectie
Hoge opbrengst
Grotere inserts
Opstellen genenbibliotheek
Vb: λ-faag
Eerste gemanipuleerde faag: ‘Charonfaag’
Insert van bepaalde grootte
12-20 kb
=> onvolledige digestie genomisch DNA met EcoRI
M13-faag
ssDNA-faag
Site-directed mutagenesis
Cosmids
do not exist in nature
these vectors have been constructed to contain features from both phages and plasmids
they have a selectable marker, multiple cloning sites from plasmids and a
cos
site from λ phage
Voordeel: grote inserts
Bijna volledige faag-genoom is verwijderd
Artificial chromosomes
used when large fragments of DNA must be cloned
bacterial artificial chromosomes (BACs)
Stabieler
Kleinere inserts
(300 kb)
Gebaseerd op F-factor E.coli
played important role in the human genome project
YACs: larger inserts, but less stable
Als vector
Slechts één replicatie per celdeling
YACs: gist TEL + CEN + ARS (replicatie) + merkergen (URA3) + MCS
Grote inserts:
1000kb
Probleem: recombinatie met chromosomen
Expressievectoren
Gastheercellen
Bacteriën
Gen afkomstig van eukaryoot
Goede promotor nodig
Induceerbaar
Heterologous genes
cloned genes, in the new host cell
may not be expressed unless they are modified
recombinant gene must have a promoter that host RNA polymerase recognizes
introduced eucaryotic genes must be modified to have a procaryotic leader sequence and all introns must be removed
expression vectors
are used to overcome problems with expression of recombinant genes in host cells
Gecontroleerde expressie
Toxisch
Inhibtie groei
Inclusion bodies
Voorbeeld
somatostatine
Gen chemisch aangemaakt (42 codons)
Start: methionine
2 stopcodons
Uiteinden: sticky-ends EcoRI en BamHI
Productie fusie-eiwit: somatostatine + stuk β-galactosidase
Losknippen met cyanogeenbromid
e
Mogelijke promotors
Lac-promotor
Lac-operon
Probleem: lekkage
Oplossing: vector extra lacI-gen (repressor)
Trc-promotor
oligohistidine-expressievector (pTrcHis)
6 extra Histidines
Opzuivering mbv affiniteitschromatografie
Achteraf verwijderen histidines (enterokinase)
Insert gehecht aan export-peptide
gemakkelijke oogst
Arabinose promotor
Pbad
Zeer gevoelige en fijen controle expressie
Inducer: arabinose
Product = fusie-eiwitten
Extra AZ
Niet erg
Helpen bij stabilisatie in gastheercel en opzuiveren
Door lacZ'
opzuiveren dmv affiniteitschromatografie mbv anti-β-galactosidase antilichamen
Lambdafaag promotor
T7 promotor
Eukaryote expressiesystemen
Probleem bij bacteriën: niet in staat tot posttranslatie-modificaties
=> eukaryote gastheercellen, vb:
bakkersgist
Meestal initiële klonering in bacterie, dan expressie in gist
=> shuttle-vectoren
Voorbeeld:
2-micron-plasmide YEp24
pBR origin of replication
Merkergenen ampR en URA3
Genetische manipulatie planten
GGO's
Ti-plasmide
Agrobacterium tumefaciens
=> integratie in chromosomen planten
tumor-inducing (Ti) plasmid
Voorbeelden
Droogte-resistente mais
Gouden rijst
Insect-resistente aubergine
Schimmel-resistente aardappel
Hoe zoek je een bepaald gen?
volledig genoom of genenbank
Hoe kan je het gewenste DNA-fragment vinden?
Ofwel
ken
je (een stukje van) de DNA-sequentie => gebruik
probe
Verschil tussen probe en primer
Beiden ssDNA/ssRNA
Probe
=>
Hybridisatie
complementair fragment
=>
DETECTIE
Primer
=>
Annealing
aan complentaire sequentie
=>
START REPLICATIE/PCR
Ofwel niet, enkel functie eiwit =>
fenotypische rescue
Informatie over eiwit
expressie gen
Opsporen cellen met gewenst fenotype (fenotypische rescue)
Bv. opsporen gen dat codeert voor alanine (expressie in alanine-auxotrofen)
Genetic Engeneering
Knock-outs
Functie
gen: Effect bij uitchakeling (KO) gen
Verstoring gen door inbouw resistentiegen tegen neomycine
Stamcellen muis
KO gen in kern: recombinatie met intacte gen (lukt slechts in klein gedeelte stamcellen)
Eliminatie
"mislukte" stamcellen
overbrengen in medium met
G418
Enkel cellen met
resistentiegen
overleven
Toediening
gancyclovir
eliminatie cellen met
onjuiste recombinatie w
ant die zijn in het bezit van het tk-gen
Injectie
muizenblastocyst
met KO-stamcellen
in zwarte moedermuis
chimere muisjes
: zwart met bruine vlekken (-> KO gen) (nog geen echte heterozygote muizen!)
Heterozygote
muizen
Kruising chimere muis met
zwarte (recessief
tov bruin) muis
bruine nakomelingen =
heterozygoot
Kruising twee bruine muizen
nakomelingen genotypisch checken op homozygositeit
Homozygote
KO-muizen
Onderzoeken op fenotypische veranderingen
Reportergenen
Opvolging expressie genen
Koppeling reporter aan regulatorische sequentie van het te onderzoeken gen
Reporter
gemakkelijk detecteerbaar
product
Vergelijken met expressie housekeeping gen
Vbn:
GFP of luciferase
Green fluorescent protein (GFP)
visualisering genexpressie + localisatie eiwitten in cel
Ondertussen mutaties zodat verschillende kleuren beschikbaar zijn
Jellyfish
Visualize gene expression and protein localization in living cells
Single gene
Easily
cloned
en expressed
Fuse GFP with structural gene =>
chimeric protein
Gentherapie
In medicine
proteïne
geproduceerd door bacteriën
in agriculture
use of
genetic engineers
allows for the direct transfer of desirable traits to agriculturally important animals and plants
RNA interferentie
Herstel patiënt zonder inbouw nieuw DNA
RNAinterferentie (RNAi)
: stilleggen van bepaalde genen = ‘
gene silencing’
miRNA versus siRNA
miRNA
Endogeen dsRNA
Regulatie genexpressie cel:
Complementair aan bepaald mRNA
Ofwel
blokkeren translatie
Ofwel
vernietiging mRNA
RISC
Enzym Dicer knipt lange dsRNA moleculen in korte fragmenten (21 nucleotiden)
één streng = ‘
guide strand
’
opgenomen in
RNA-induced-silencing complex (RISC)
binding op complementair mRNA
1 more item...
siRNA
Selectief + drastisch
Interessant
Exogeen dsRNA
geknipt door Dicer
Bindt aan doelwit mRNA
afbraak / verhinderen translatie
Verschil
miRNA
: minder strikte baseparing --> inhibitie translatie
verschillende
mRNAs
siRNA
: heel strikte binding --> inhibitie slechts één
specifiek
mRNA
CRISPR-CAS
verdedigingsmechanisme
van bacterie tegen virussen
Bacterie legt een soort ‘geheugen’ aan in zijn eigen chromosoom
elk nieuw viraal DNA wordt
opgeslagen
in zijn DNA
Bij volgend contact met virus
combinatie CAS-enzyme met guide-RNA
complementair met
viraal
DNA
binding CAS op DNA
(thv PAM site)
vernietiging
DNA
Toepassing
Toevoegen stukje homoloog RNA (aan target –gen) aan CAS-enzym =‘
guide RNA
’
Herkenning + binding aan target DNA
CAS knipt target DNA
DNA- herstel-apparaat cel --> herstel, maar met fouten --> onwerkzaam gen = ‘knock-out’
