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Biomol Experimental: Protocolos - Coggle Diagram
Biomol Experimental: Protocolos
1 - Extração de DNA genômico
Protocolo
a) Centrifugar;
Adcionar ao microtubo, em que aas células estão, 600µL do reagente Nuclei Lysis;
Ressuspender as células com auxilio do vórtex;
Incubar por 5 min a 65ºC
b) Após a última fase do item a, adicionar 3µL de RNAse, homogeneizando com a ponteira;
Levar para incubadora por 5 min, a 37ºC;
c) Retirar da incubadora e deixar por 5 min descansando em temperatura ambiente;
d) Adicionar 200 µL solução de Protein Precipitation
Levar ao vórtex
e) Incubar no gelo por 5min;
f) Levar a centrífuga por 5 min, a 13 000 rpm;
i) Descarte do sobrenadante;
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g) Transferir sobrenadante para um outro microtubo;
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2 -Eletroforese e dosagem de DNA
Protocolo de quantificação
a) Fazer a diluição do DNA extraído com H2O ultrapura; (volume utilizado = 10µL)
b) Levar ao espectofotometro a 260nM, 280nm e 230nm
Realizar leitura do branco;
c)Realizar o cálculo de concentração da amostra
Realizar cálculo das razões A260/A280 e A260/A230
Protocolo de Eletroforese
Protocolo de Preparação do Gel de Agarose 8%
a) Pesar 0,8g de agarose;
b) Adicionar tampão TBE0,5X (100mL)
c) Promover a dissolução completa da agarose via banho maria ou micro ondas
Obs:
Manter o frasco em agitação durante todo o processo
d) Verter a agarose na forma apropriada até que atinja 5mm;
Colocar o pente
Eliminar as bolhas, que possam ter formado, com uma micropipeta
e) Esperar a gelificação em temp. ambiente (30 min à 1h)
f) Retirar o pente do gel, lentamente para evitar danificação dos poços;
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Protocolo de aplicação para o teste
a) Para cada amostra preparar um microtubo com:
5µL de preparação de DNA;
3µL do tampão de amostra;
Adicionar um padrão de massa molecular, de acordo com o fabricante aplicar 3µL no gel;
b) colocar as amostras em seus poços;
c) Ligar o aparelho, regular a ten~sao para 100w;
d) Quando o azul de bromedol atingi em torno de 3/4 de comprimento do gel, desligar o aparelho;
e) Retirar o gel, com cuidado;
Leva-lo a banho, por 15-30min, em solução de brometo de etídeo 0,5µg mL-1
f) Examinar o gel sob radiação UV, pra ver os resultados obtidos;
3- PCR
Protocolo
a) Retirar o DNA e reagentes do freezer, deixa-los em banho de gelo;
b) Proceder com os procedimentos de higienização das mãos, colocar luvas;
c) Higienização da banca de trabalho com álcool 70%;
d)Identificações dos tubos que serão trabalhados nas reações ;
e) Realizar o preparo do mix de PCR, como descrito no roteiro (tabela 1- vol de 50µL)
f) Colocar em cada tubo: 48µL do mix de PCR;
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Se ater a registros das amostras que serão trabalhadas;
Obs:
A Taq DNA deve estar constantemente refrigerado;
4 - Reação de ligação de produção de células competentes
1º Protocolo: de Purificação dos produtos de PCR
a) Utiliza-se em torno de 90µL de produto de PCR;
b) Adiciona-se ao microtubo 225µL de etanol absoluto gelado;
c)Adicionar ao microtubo do passo b 90µL de produto de PCR;
d)Logo depois, adicionar 9µL de acetato de sódio 3 mol L- 1 pH 7,0 gelado;
e) Centrifugar a 14000 rpm por 10 min;
f)Adicionar 1mL de etanol 70% gelado ao microtubo;
g) Centrifugar a 14000 rpm por 5 min;
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Obs:
Após centrifugação, realizar o descarte do sobrenadante
Obs:
As duplicatas das reações se foram feitas em função disso;
2º Protocolo: Reação de ligação
Recomendação do fabricante
a) Utiliza-se proporção 1:3 de vetor para inserto;
b) Pipeta-se as reações como na tabela fornecida no roteiro;
Obs:
Cuidado, antes de se pipetar o tampão de lig. deve-se levar o tubo ao vórtex;
c) Misturar os componente com a pipeta
d) Incubar por 1h em temp ambiente;
Ou, faz uma incubação overnight a 4º, para um nº máximo de ligações;
Preparação de células
E.coli
competentes
a) Cultivar cepa de
E.coli
(pré-inóculo), em ultrafreezer a -70ºC
b) Incubar 5mL da cultura em meio LB de 100mL;
c)Transferir a cultura para tubos Falcon de 50mL
d)Coletar as bactérias por centrifugação a 4000 min-1, por 5min a 4ºC;
e) Ressuspender o sedimento celular, em 10mL de CaCl2 0,1 mol L-1 gelado;
f) Manter em banho de gelo por 20min.
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Obs:
Realização requer tato e gentileza na hora de manipular;
Incubar em gelo por 10min;
Condições:
- a 37ºC - sob constante agitação, até se atingir DO600nm próxima de 0,8;
Condições:
- Meio líquido LB;
37º C, 150 min-1, por 16h;
5 -Transformação de Células de E.coli competentes
Protocolo:
a) Separar uma alíquota de 100µL de célula de
E.coli
competente;
b) Adicionar 5µLde mistura de ligação ;
c) Incubar por 20min em banho de gelo;
d) Choque térmico em banho maria a 42ºC por 2min;
e) Incubar em banho de gelo por 2min.
f)Adicionar 90µL de meio LB;
g)Transferir para um tubo Falcon de 15mL;
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6- Extração de DNA Plasmidial
Protocolo:
a) Inocular mL de meio LB (presença de antibiótico) com uma colônia de cepa bacteriana
Incubar a 37ºC com agitação 150 rpm durante aproximadamente 16h.
b) Transferir 1,5mL da cultura para um microtubo
Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4ºC
c) Descarte do sobrenadante
d) Repetir passo b
e) Centrifuga Falcon: centrifugar a 5000 rpm por 10min a 4ºC; descarte de 4mL do sobrenadante; ressuspenção do pellet; transferência para um microubo de 1,5 ml; centrifugação por 5 min a 12000 rpm a 4ºC
f) Descarte do sobrenadante;
g)Suspensão do sedimento em 100µL da solução A (Glicose 50mM; Tris-Hcl 25mM; EDTA 10mM);
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Digestão com Enzimas de restrição
Protocolo:
a) Adicionar em um microtubo de 0,2mL : 6,5µL de H2O estéril; 2µL de DNA; 1µL de Tampão 10X; 0,5µL de enzima;
b) Homogeneizar cuidadosamente com auxílio de uma pipeta;
c) Incubação por 1h a 37ºC;
d)Incubação de 20min a 65ºC (inativação da enzima);
e)Utilizar 5µL da reação para avaliação de resultado em um gel de agarose 1%;
f) Armazenar a -20ºC, se houver necessidade;
