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CLONAGEM MOLECULAR, Extração do DNA genômico - Coggle Diagram

- - - - Transformação de células de E.coli competentes
        
        Extração do DNA plasmidial
        
        Digestão com enzimas de restrição
        
        1) Adicionar os componentes listados a seguir em um microtubo de 0,2 mL. Água estéril: 6,5µL; DNA:2µL; Tampão 10X:1µL; Enzima 0,5: µL.
        
        2) Homogeneizar cuidadosamente com a pipeta e se necessário utilizar o spin down para assegurar que nenhum reagente ficou nas paredes do tubo.
        
        3) Incubar por uma hora a 37 ºC
        
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        1) Inocular 5 mL de meio LB (contendo o antibiótico apropriado: no caso deste protocolo é a ampicilina) com uma colônia da cepa bacteriana (ou 100 µL de cultura em meio líquido). Incubar a 37°C com agitação (150 rpm) durante a noite (~ 16 horas).
        
        2) Transferir 1,5 mL da cultura para um microtubo e centrifugar a 12.000 rpm por 5 min a 4 °C.
        
        3) Descartar o sobrenadante e repetir o passo 2.
        
        4) Caso tenha uma centrífuga de tubos Falcon, é possível centrifugar a 5.000 rpm por 10 minutos a 4 ºC, descartar 4 mL do sobrenadante; ressuspender o pellet; transferir para um microtubo de 1,5 mL e centrifugar a 12.000 rpm por 5 min a 4 ºC.
        
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        1) Separar uma alíquota de 100 µL de célula de E.coli competente.
        
        2) Adicionar 5 µL de mistura de ligação (plasmídeo + inserto).
        
        3) Incubar em banho de gelo por 20 min.
        
        4) Choque térmico em banho-maria a 42 ºC por 2 min.
        
        5) Incubar em banho de gelo por 2 min. 6) Adicionar 900 µL de meio LB.
        
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      - 1) Purificação do Produto da PCR
        
        1) Partiremos de aproximadamente 90 µL de produto de PCR (por esse motivo foram feitas duplicatas das reações. Cada reação de PCR foi feita para um volume final de 50 µL, sendo que 5 µL foram gastos para fazer o gel)
        
        2) Em primeiro lugar, adicionar a um microtubo 225 µL de etanol absoluto gelado.
        
        3) Adicionar ao etanol absoluto gelado os 90 µL de produto de PCR
        
        4) Adicionar 9 µL de acetato de sódio 3 mol L-1 pH 7,0 gelado.
        
        5) Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos e descartar o sobrenadante.
        
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        2) Reação de Ligação
        
        Utilizando o protocolo fornecido pelo fabricante da enzima:
        
        1) Recomenda-se utilizar uma proporção de 1:3 (unidades de massa) de vetor para inserto (isto já está previsto na tabela 1 fornecida na bula).
        
        2) Pipetar as reações como na tabela 1 fornecida na bula. Antes de pipetar o tampão de ligação, devese levar o tubo ao vórtex brevemente.
        
        3) Misturar os componentes da reação por pipetagem. Incubar por 1 h em temperatura ambiente. Alternativamente, incubar as reações overnight a 4ºC para um número máximo de ligações.
        
        Preparação de células E.coli competentes:
        
        1) Cultivar uma cepa de Escherichia coli (pré-inóculo), em ultrafreezer a -70ºC, nas seguintes condições: a. Meio líquido Luria Bertani (LB) (triptona 1 %; extrato de levedura 1 %; cloreto de sódio 0,5 %; pH 7,5) b. 37°C, 150 min-1, durante 16 horas
        
        2) Incubar 5 mL dessa cultura em 100mL de meio LB, a 37°C e sob agitação, até atingir a DO600nm próxima de 0,8.
        
        3) Transferir esta cultura para tubos Falcon de 50 mL e incubar em gelo por 10min.
        
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    - - 2) Lavar as mãos e colocar luvas.
        
        3) Limpar a bancada com álcool 70%.
        
        4) Identificar os tubos que serão usados nas reações. Deve-se criar um registro das amostras que serão amplificadas no caderno de laboratório.
        
        5) Preparar o mix de PCR, como descrito na tabela 1, para um volume final de 50 µL.
        
        6) Distribuir 48 µL do mix de PCR sem o DNA em cada tubo.
        
        7) Adicionar 2 µL de DNA (x ng/µL) em cada tubo, exceto no tubo do controle negativo. Homogeneizando gentilmente.
        
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  - - - Pesar 0,8 g de agarose.
        
        Adicionar 100 mL de tampão TBE 0,5X.
        
        Aquecer em banho fervente ou micro-ondas até a completa dissolução da agarose. O frasco deve ser agitado frequentemente.
        
        Após a solubilização, a solução de agarose deve ser resfriada (até conseguir segurar com as mãos)
        
        . 5. Verter a agarose na forma até uma altura de aproximadamente 5 mm e colocar o pente que forma as canaletas para aplicação das amostras. Eliminar bolhas de ar que tenham se formado aspirando com uma micropipeta
        
        Aguardar a gelificação à temperatura ambiente por 30 min a 1 h.
        
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      - Para cada amostra, misturar em um microtubo: a. 5 µL da preparação de DNA b. 3 μL do tampão de amostra OBS: um padrão de massa molecular também será usado, de acordo com instrução do fabricante, aplicar no gel 3 µL.
        
        Aplicar as amostras nos respectivos poços,
        
        Colocar a tampa na cuba. Verificar se as amostras estão colocadas do lado do polo negativo
        
        Ligar os cabos à fonte de eletricidade. Ligar a fonte e regular para uma tensão de 100 volts.
        
        Após a migração (avaliar pela posição do azul de bromofenol, 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da cuba.
        
        Retirar o gel cuidadosamente para não partir e corá-lo em banho com uma solução de brometo de etídeo 0,5 μg mL-1, durante 15-30 min em temperatura ambiente. .
        
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  - - - Proceder às leituras em espectrofotômetro a 260 nm; 280 nm e 230 nm. Não squecer de fazer a leitura do branco (água, para este caso)
        
        Calcular a concentração da amostra (equação 1) e as razões A260/A280 e
        A260/A230.
- - - - 4) Adicionar 200µL de “Protein Precipitation Solution” e homogeneizar no vórtex.
        
        5) Incubar em banho de gelo por 5 minutos.
        
        6) Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.
        
        7) Transferir o sobrenadante para um novo microtubo e adicionar 600µL de isopropanol gelado, homogeneizar invertendo o tubo 3x
        
        8) Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.
        
        9) Descartar o sobrenadante e adicionar 600µL de etanol 70% gelado.
        
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