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GENETICA MEDICA, MOSAICISMO - presenza di due o più linee genetiche…
GENETICA MEDICA
CITOLOGIA MOLECOLARE
- tecniche per identificare con precisione un intero cromosoma o un suo frammento sulla base della specificità dell'accoppiamento base-base
FISH - ibridazione in situ fluorescente --> tecnica citogenetica molecolare per visualizzare localizzazione e numero copie di una sequenza specifica attraverso sonde fluorescenti
bisogna sospettare prima a livello clinico il pezzo mancante o duplicato - non sempre possibile
risoluzione 40-1000000 lettere
le sonde a fluorescenza legano in maniera selettiva per complementarietà specifiche regioni del cromosoma
per costruzione mappe fisiche -identificazione posizione sequenza su cromosoma
dalla capacità del DNA di denaturarsi in maniera reversibile e legame con sequenza complementare - poi osservato al microscopio a fluorescenza
in metafase o su nuclei in interfase, da sangue, biopsie o liquido amniotico
può essere utilizzata per specifici target come cellule tumorali, miRNA o mRNA
per diagnosi anomalie cromosomiche - es. diagnosi prenatale
ampia applicazione in campo oncologico es. HER2 per tumore mammario maligno
MICROARRAY CGH --> vetrini da microscopio con centinaia di frammenti di DNA che funzionando da sonde per mRNA --> per monitorare espressione singolo gene
campione persona da testare e campione di riferimento;
colorazioni diverse: persona in rosso e riferimento in verde;
mixati su piastra fisica con milioni di sonde in pozzetti (pezzo di DNA per micro-pozzetto --> si ibrida con campioni che poniamo sopra) --> giallo indica quantità uguali; se prevale il campione (rosso) indica duplicazione; se prevale il riferimento (verde) indica delezione
tutto interpretato da computer e algoritmi che danno un grafico --> allineamento su 0 equilibrio, se abbiamo +/- 0.5 indice di alterazione
SNP array- utilizzo singoli nucleotidi per avere risoluzione intragenica ibridando DNA --> variabilità maggiore
NEXT GENERATION SEQUENCING --> possibilità di sequenziare intero genoma per individuare patologie eterogenee con alla base anche 15 geni mutati es. nanismo acondroplastico
prima SEQUENZIAMENTO SANGER per sequenziare un gene - amplificazione singolo pezzetto - mettiamo terminatori della catena che con 4 fluorofori diversi vedono le basi
DNA polimerasi con dideossiribonucleosidi trifosfato alla fine
analisi di ampliconi -lettere captate da micro-segnali luminosi con fluorofori per lettere --> rilevati da laser e sequenziamento al computer
TEST DIAGNOSTICO
- per diagnosi su probabilità mutazione gene
TEST PREDDITIVO - dà probabilità di ammalarsi di una patologia
es. per BRCA1 e BRCA2 - rischio carcinoma a mammella e ovaio
TEST DEL PORTATORE SANO - per individuare portatori sani per esempio in un indagine a cascata dopo figlio del fratello malato
TEST PRESINTOMATICO - su soggetto sano
es. per Corea di Huntington - condizione peso associata a mutazione dinamica --> espansione delle triplette con patologia a 36 ripetizioni CAG
TEST DI FARMACO-GENOMICA - modulazione reazione farmaco in base a genotipo del soggetto che lo deve assumere
TEST PRENATALE
screening II trimestre
- ecografia morfologica a 20/22 settimane per studio anatomia fetale --> arti, dita, 4 camere cardiache
screening III trimestre
- flussimetrie
screening I trimestre
Bi-test:
10/12 settimane ecografia NT (nuchal translucency) --> spessore in mm dietro nuca (plica nucale) --> se aumentato -->probabilità sindrome di Down;
12/13 settimane NIPT --> ricerca DNA fetale circolante nel sangue materno --> evidenzia eventuali anomalie cromosomiche e sesso feto
se evidenza di anomalie --> test invasivi:
villocentesi
- prelievo transaddominale di membrane che compongono trofoblasto, da cui origina DNA fetale che si libera nel sangue materno - per geni malattia o anomalie cromosomiche numeriche
amniocentesi
- rischio + basso perché tessuto di eiezione=liquido amniotico - effettuato a 15-20 settimane; per conferma cariotipo
cordocentesi
- sangue fetale prelevato con ago da cordone ombelicale per discriminare mosaicismi o malattie infettive es. toxoplasmosi
utilizzato in ambito di approccio clinico --> sospetto clinico - test - convalida diagnosi clinica - terapia appropriata
genetica della popolazione per costruire alberi genealogici e conoscere probabilità empiriche su base mendeliana/statistica
es. fibrosi cistica in Italia - incidenza 1/2500 e portatori sani 1/25
equazione di Hardy-Weinberg
- a un tot di malati corrisponde un tot di portatori sani per malattie recessive o legate a X
TEST PREIMPIANTO - PGD
test di procreazione mediatamente assistita - analisi genetiche su embrione allo stadio di blastocisti
LEA - livelli essenziali di assistenza --> definisce ruolo genetista
MUTAZIONI
GENICHE - per uno o più nucleotidi
missenso
- cambia base azotata --> trasduzione diverso aa; -
non sense
- cambia base azotata dando codone di stop --> proteina tronca; -
frameshift
- inserzione o delezione base azotata --> alterazione modulo di lettura e tutti aa modificati
mutazioni recessive
: necessaria ereditarietà due copie di gene mutato
mutazione dominante
: porta a espressione fenotipica dell'alterazione nonostante sia presente un allele normale
Espressività --> variabile per sintomi e manifestazioni cliniche
penetranza --> espressione completa, moderata, minima o assente
mutazioni legate a X
mutazioni somatiche
: alterazioni per qualsiasi cellula dell'organismo diversa da gameti
mutazione de novo
: diagnosticata in individuo ma non presente de novo
CROMOSOMICHE - per uno o più cromosomi
anomalie di numero -
aneuploidia
(no multiplo 46 - trisomia o monosomia) o
poliploidia
(multiplo 46 - raramente compatibili con vita)
aneuploidie
- da non disgiunzione durante meiosi I o II -->
lag anafasico
--> fuso mitotico perde tempo nel trasporto o perdita cromosoma per cellula figlia per mancata inclusione
TRISOMIA 18 o Sindrome di Edwards --> bocca piccola, collo corto, anomalie gabbia toracica, orecchie displastiche e malformate, cranio con regione occipitale prominente, indice e medio sovrapposti a medio e anulare, alluce verso l'alto e calcagno prominente
TRISOMIA 21 o Sindrome di Down --> libera (evento sporadico) o Robertsoniana sbilanciata (4% - madre portatrice)
soggetto portatore + soggetto normale possono determinare cariotipo normale, monosomia 21 (NC), monosomia 14 (NC), trisomia 21, trisomia 14 (NC) o traslocazione bilanciata (-->portatore)
se madre portatrice alto rischio - maschio generalmente sterile
TRISOMIA 13 o Sindrome di Patau - forma molto grave - /20000 nati --> grave ritardo mentale, cardipatie congenite, labiopalatoschisi, ciclopia (problemi chiusura cranio) e polidattilia
da genitori portatori di traslocazione 13/14
anomalie di struttura
delezione
- perdita porzione
inversione
- porzioni al contrario durante duplicazione
duplicazione
- parte di cromosoma si duplica per zone ripetute; se successiva alla stessa è detta 'in tandem'
inserzione
- pezzo di DNA si inserisce in una parte errata
traslocazione
- due cromosomi si spezzano e scambiano parte di DNA
reciproche o perdita apparente
es. Robertsoniana - coinvolge cromosomi acrocentrici con formazione cromosoma con due braccia lunghe dei cromosomi coinvolti
nuovo cromosoma costituito dalla braccia lunghe dei due elementi originali, e un piccolo cromosoma costituito dalle due braccia corte, che di solito viene perduto
anomalie cromosomi sessuali
SINDROME DI TURNER (
disgenesia gonadica
- X) --> soggetto di sesso femminile, con insufficienza ovarica, bassa statura, coartazione aortica, torace malformato, V dito più corto, problemi di apprendimento; secondo delle stime - responsabile del 10% degli aborti spontanei negli Stati Uniti
SINDROME DI KLINEFELTER (XXY) --> soggetto di sesso maschile con testicoli ipertrofici, spermiogramma on assenza di spermatozoi, aspetto ginoide con sviluppo ghiandola mammaria, grasso sottocutaneo distribuito come in femmina, meno peluria, altezza maggiore della media
MOSAICISMO CROMOSOMICO - anomalia cromosomica solo in alcune cellule es. trisomia 8 a mosaico
es. cromosoma di dimensione anomale in Sindrome Cat Eye - cr 22 malappaiato
es. moltiplicazione braccio corto in Tetrasomia 12p o Sindrome di Pallister Killian (sintomatologia cutanea)
GENOMICHE - per intero genoma - es. sindrome di Williamson con alterazione DNA con risoluzione diversa
sindromi per riarrangiamento microcromosomico
- alterazioni nelle braccia dei cromosomi (non visibili con tecniche di citogenetica tradizionale)
SINDROME DI PRADER-WILLI --> per diversi meccanismi ma + comune: microdelezione su cromosoma 15 - solo su cr paterno abbiamo malattia da imprinting e solo su cr materno abbiamo malattia di Angelman
siti di metilazione persi determinando spegnimento sequenza normalmente accesa su cromosoma paterno
pazienti paffuti, sciocchi, difficoltà di alimentazione, impossibilità a reggere il capo, ipotelorismo, aumento peso per iperfagia, palato alto, stretto e ogivale, ipergonadismo, attività intellettiva media o lieve, dieta affusolata e corte
SINDROME DI ANGELMAN
bimbi di bassa statura e microcefalia, disabilità intellettiva, assenza linguaggio con epilessia, aspetto di risata costante (happy puppets), occhi celesti, denti piccoli e iperdistanziati; sindrome di atassia - difficoltà di equilibrio e camminata con base allargata
SINDROME DI WILLIAMS-BEUREN --> microdelezione 7q11.23 - mancanza gene per elastina
iride stellata, occhi epicanti, bambini giocosi e affidabili, ritardo mentale medio, labbra piene e carnose, naso corto, punta globosa, narici antiverse, stenosi sovravalvolare aortica
SINDROME DI GEORGE --> microdelezione 22q11.2
perdita 1.5 milioni lettere tra cui fattore di trascrizione tdx1 importante per sviluppo archi bronchiali
anomalie cranio-facciali e cardiopatia congenita (difetti tronco arterioso), alterazioni otorinolaringoiatre come palatoschisi, ritardo mentale lieve e aspetti psichiatrici come schizofrenia, occhi con elicanto, stretti e allungati, naso dritto e lungo, orecchie anteverse e dismorfiche, labbro inferiore estroflesso
EPIGENETICHE - per ultrastruttura DNA
per impacchettamento necessarie molecole che attacchino gruppi metile sugli istoni per
metilazione
--> permette livello di espressione genica bloccando mRNA
epigenetica
: controllo espressione genica a livello cellulare - studio dei cambiamenti ereditari che non dipendono da cambiamenti basi
DNA
alterazioni determinano
malattie mendeliane
: malattie dovute alla mutazione di un singolo gene che ha effetto su una proteina - sindromi monogeniche
diverse da 'aggregazione familiare' - malattie non legate a X es. psoriasi o ipertensione
Sindrome Golabi Behemel (SGBS) - rara sindrome neonatale con macrocefalia, labbra inspessite, bocca larga, macroglossia, voce rauca, palato alto e arcuato, malposizionamento denti e mascella prominente, collo corto e epatosplenomegalia
-->
malattie recessive X-linked
generalmente nessun figlio maschio affetto è malato o porta il gene e tutte le femmine saranno portatrici e i loro figli maschi sicuramente malati
es. emofilia, distrofia di Dachenne o daltonismo
fenotipo più frequente nel maschio e femmina affetta solo in omozigosi - in genere portatrice
doppia elica asimmetrica e destrosa, basata sulla complementarietà delle basi (A-T e C-G); due eliche si uniscono e superavvolgono in
nucleosomi
a formare la
cromatina
--> ultraimpacchettata in
cromosomi
desossiribosio (zucchero pentoso) -legami fosfodiesterici - basi azotate (pirimidine e purine) che forano ponti a idrogeno
CROMOSOMA - molecola di DNA e proteine associate formato da due cromatidi uniti nel
centromero
cromosomi omologhi
- cromosomi con patrimonio genetico analogo che si appaiano durante meiosi
allele
- due o più forme alternative di uno stesso gene nella stesa posizione su ciascun cromosoma omologo; la posizione è chiamata
locus genico
l'effetto di uno può essere
dominante
sull'altro, definito
recessivo
GENE - unità ereditaria fondamentale degli organismi viventi
sequenza promotrice (PROMOTER) per regolare l'espressione genica
INTRONI - sequenze non codificanti - trascritte nel pre-mRNA e poi eliminate durante lo splicing
mutazioni su siti di
splicing possono dare problemi
splicing non avviene correttamente --> alterazione x traduzione
ESONI - sequenza codificante
90% delle mutazioni che danno malattia si trovano sugli esoni
SNP - POLIMORFISMO A SINGOLO NUCLEOTIDE --> variazione per un nucleotide e allele polimorfo in più dell'1% della popolazione
importante capire se abbiamo una mutazione che causa malattia o un SNP che non è patologica ma determina una predisposizione
utili in genetica forense o per test paternità --> mettendo insieme SNPs su cromosoma determina unicità persona
corrispondono in genere a mutazioni silenti
ESPANSIONE DI TRIPLETTE - malattie causate da un'espansione a ogni generazione della mutazione
es. distrofia miotonica - malattia muscolare caratterizzata da miotonia e danni multiorgano e grande ritardo mentale alla nascita
es. sindrome dell'X fragile o di Martin-Bell - rara condizione genetica ereditaria con ritardo globale dello sviluppo, disabilità intellettiva, disturbi nell'apprendimento e capacità a relazionarsi con altri
ripetizione codone CGG + di 230 volte sul gene FMR1 --> metilazione citosine nel promotore del gene --> silenziamento espressione genica
meccanismo di anticipazione - nelle generazioni la malattia si presenta precocemente e con quadro clinico più severo
LEGGI DI MENDEL
DELLA SEGREGAZIONE - durante produzione gameti coppie di alleli si separano per ricostruirsi con unione di gameti nella fecondazione
DELL'ASSORTIMENTO INDIPENDENTE - alleli di geni diversi segregano in modo indipendente gli uni dagli altri in metafase I --> 4 combinazioni diverse
se alleli molto vicini possibile segregazione 'linked' o se lontani possono essere invertiti da crossing over
DELLA DOMINANZA - individui ibridi della generazione F1 manifestano solo tratto dominante presente nella generazione parentale
Quadrato di Punnett
- metodo per rappresentare tutte le possibili combinazioni fra gameti per particolare allele
CITOGENETICA CLASSICA E CITOGENOMICA
cariotipo
: costituzione del patrimonio cromosomica di una specie da punto di vista numerico e morfologico
perché farlo e quali cellule si utilizzano
per analisi costituzionale --> linfociti;
per sospetto mosaicismo germinale --> fibroblasti;
amniociti o cellule del midollo perché dividono spontaneamente
cromosomi si presentano diversamente in base alla sottofase della metafase in cui si trovano al momento del prelievo - tentativo di blocco in coltura in prometafase
metafase precoce: più lunghi e dettagliati; verso citodieresi: più compatti e piccoli
classificazione
posizione centromero
metacentrici
--> centrale;
submetacentrici
--> spostato su un lato;
acrocentrici
--> alla fine (13, 14, 15)
braccio corto
p
e braccio lungo
q
grandezza - ordinati dal più grande al più piccolo
bandeggi
bandeggio C
- per zone altamente ripetute (centromeri o zone pericentromeriche)
bandeggio R
- specifico per zone ricche di CG
bandeggio Q/G
con Giemsa e chinacrina (fluorescente)
legano entrambe regioni ricche di AT (eurocromatina - bande scure) --> Giemsa determina bande scure e chinacrina bande chiare su sondo scuro --> se sovrapposte complementari
più è lungo il cromosoma e più bande vengono identificate e ognuna avrà sottobande (visibili aumentando risoluzione)
prima banda da centromero verso telomeri
sviluppo farmaci e terapie sulla base dei meccanismi d'azione delle molecole ce causano malattie
ETEROGENICITA' GENETICA - mutazioni di geni su loci diversi che possono dare lo stesso fenotipo
MOSAICISMO - presenza di due o più linee genetiche diverse - diversi patrimoni genetici espressi in un individuo contemporaneamente
per irregolari divisioni cellulari o mutazioni per numero e struttura cromosomi in embrione
