Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Tecniche di analisi proteica - Coggle Diagram
Tecniche di analisi proteica
Lisi cellulare
Centrifugazione frazionata
DIALISI E ULTRAFILTRAZIONE
Analisi di proteine per proprietà
(cercare di isolare un'unica proteina o molto simili)
ELETTROFORESI
Si utilizza una lastra di gel polisaccaridico alle cui estremità vengono posti dei poli che creno un campo magnetico.
Questo permette di
dividere le proteine in base alla loro carica
e all'attrito che incontra per muoversi all'interno del gel (più grande meno passa), ovvero
rispetto alla dimensione
della proteina
SDS
Un tipo di elettroforesi che permette la separazione solamente in base alla loro dimensione e non in base alla carica
Questo perché le proteine vengono fatte reagire con un
detergente anionico denaturante ovvero l'SDS
L'SDS denatura le proteine e lega in modo stechiometrico ai residui della proteina
(più è grande la proteina più si lega l'SDS più è carica la proteina)
.
1 more item...
L'SDS è un detergente che rompe la struttura terziaria delle proteine e lega un gruppo funzionale estremamente negativo alla proteina.
Bidimensionale
Su una dimensione le proteine si dividono nel gel in base al punto isoelettrico
Vengono poi posti su un secondo gel a SDS che con direzione perpendicolare alla prima li divide in base alla massa
Risulta essere un processo molto utile per seguire la purificazione di un campione proteico tramite cromatografia
Dall'elettroforesi si distingue facilmente se ci sono ancora proteine molto diverse in soluzione
Cromotografia
su colonna
AD
AFFINITA
Viene
sfruttata l'affinità
di una proteina con un determinato suo
ligando
Sono necessarie conoscenze pregresse perché è necessario sapere qual è il ligando specifico della proteina (spesso enzima) perché questa si possa legare ma è anche l'unico metodo che permette in un unico passaggio l'isolamento di una specifica proteina
Fase stazionaria:
la matrice contiene del ligando specifico per la proteina di nostro interesse immobilizzato alla matrice
Fase mobile I :
soluzione acquosa di proteine che percola nella matrice permettendo alla proteina desiderata di legarsi alla matrice lasciando le altre percolare
Fase mobile II:
soluzione contenente del
ligando mobile compete con il ligando della matrice
per il legame con la proteina portando perlomeno parte della proteina a venir via dalla matrice legata al ligando mobile
AD
ESCLUSIONE MOLECOLARE (GPC)
Sfrutta la diversa dimensione delle proteine per separarle
Le proteine più grosse non entrano nei pori delle sfere passando attraverso gli interstizi delle sfere non instaurando interazioni con i gel e uscendo prima dalla matrice:
le proteine più grosse escono prima e le più piccole dopo
Fase stazionaria:
costituita da una serie di sfere di polisaccaridi polimerizzati che sono porosi
SCAMBIO
IONICO
Sfrutta le diverse interazioni elettrostatiche basate sull'intensità di carica delle proteine ad un dato pH
Infatti conoscendo l'intensità di carica di una determinata proteina ad un determinato pH posso creare una matrice tale che quella proteina a quel pH si leghi alla matrice.
Una volta che la mia proteina si è legata alla matrice per staccarlo poi o dovrà cambiare il pH o usare un competitore con la matrice
Fase stazionaria:
matrice polimerica con
gruppi anionici o cationici
Fase mobile:
soluzione acquosa a pH controllato
A
FASE INVERSA
Sfrutta la diversa idrofilia delle proteine dopo averle legate ad una matrice idrofoba
Fase mobile II:
soluzione acquosa cosicché le proteine possano uscire prima in base alla loro idrofilicità
Fase stazionaria:
colonna di idrocarburi quindi ad altra idrofobicità
Fase mobile I:
prima soluzione di proteine denaturate i cui radicali idrofobici risultano quindi scoperti.
Consiste in un tipo di separazione di macromolecole che le divide in base alle
diverse interazioni
con una matrice
Le proteine da separare vengono disciolte in una soluzione che viene definita
FASE MOBILE
La fase mobile viene fatta percolare in una colonna che possiede diverse caratteristiche:
MATRICE IMMOBILE/
FASE STAZIONARIA
A seconda del tipo di matrice alcune proteine interagiranno con la metrice stessa, percolando più lentamente:
LA CROMATOGRAFIA SI BASA INFATTI SUI DIVERSI TEMPI DOI PERCOLAMENTO DELLE PROTEINE A CAUSA DELLE DIVERSE INTERAZIONI CON LA MATRICE
1 more item...
Identificazione di
STRUTTURA PRIMARIA
di una proteina (da quale sequenza di aa è formato)
vai dal
nucleotide
Per identificare la struttura primaria di una proteina ultimamente si fà riferimento al nucleotide che la ha sintetizzata: poiché ogni 3 sequenze nucleotidiche corrispondo ad uno ed un solo amminoacido.
Più semplice ma non ti aiuta a comprendere se quella proteina è precisamente nel tuo campione
Spettrometria di massa
Le proteine vengono portate in forma ionica e gassosa (distruzione delle proteine)
Vengono portate in una camera ad altissima pressione dove vi è un rilevatore che rileva o
il tempo di volo della proteina o
la deviazione della traiettoria della proteina quando sottoposta a campo magnetico
Permette di identificare con grande precisione la massa della proteina e quindi da questa la sequenza primaria della proteina stessa.
Degradazione di Edman
Viene rilasciato un reattivo nella soluzione proteica che ad alto valore di pH si lega con l'estremitrà N-terminale della proteina stessa
Ricambiando i valori di pH il reattivo si stacca staccando anche il primo amminoacido, che può di conseguenza essere analizzato e scoperto,
Facendo questa cosa una 50ina di volte si può definire la sequenza primaria di una proteina confrontandola con altri database
1 more item...
Identificazione
STRUTTURA TERZIARIA
BIOCRISTALLOGRAFIA
e mappa
Una proteina viene fatta collassare per disidratazione e viene formato un
cristallo della proteina
Questo cristallo viene
irradiato da raggi x
: gli
elettroni del raggio vengono difratti in base alla densità elettronica della proteina
che ne ostacola il passaggio nel cristallo
Si ottiene una sorta di
proiezione sul piano degli elettroni
che se svolta da diverse angolazioni poi integrate tramite passaggi matematici posso ricostruire la struttura terziaria di una proteina.
1 more item...
Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare NMR
Questa analisi deve essere svolta su proteine sintetizzate esclusivamente da specifici isotopi (H1, C13, N15 e P31) e su proteine di cui già si conosce la struttura primaria.
Per fare questo basta far sintetizzare a una colonia batterica le proteine che vogliamo fornendo loro quel determinato tipo di isotopi e useranno quegli isotopi per sintetizzare le proteine
Questi isotopi se immersi in un
campo magnetico
orientano il loro spin
(il movimento dei protoni attorno ad un asse nucleare) in modo differente
Lo spin varia in formazioni più energetiche nel momento in cui è colpito da uno stimolo, ovvero da delle sequenze radio a frequenza specifica.
1 more item...
Conoscere la struttura primaria e terziaria di una proteina è importante per confrontare origine evoluzione e funzione di diverse proteine
BIOINORMATICA:
è una branca di studio che utilizza dei software per comparare le sequenze primarie delle proteine allineandole l'una con l'altra
Analizzando infatti due proteine si può dedurre se queste
derivano da un progenitore comune
(essendo quindi
OMOLOGHE
) in base al loro numero di
identità, ovvero di amminoacidi uguali posti nelle stesse posizioni
Sono tuttavia accettati dei
GAP
ovvero delle parti in cui l'identità non è rispettata imputabili all'evoluzione
1 more item...
Dopodiché è necessario separare l'insieme di proteine dove presumibilmente si trova quella di nostro interesse dalle tutte le altre micromolecole
Dialisi:
il contenuto di proteine si immette in una membrana a piccoli pori attraverso cui fuoriescono solo le micromolecole
Si utilizza una centrifuga che divide le differenti parti della cellula in base alla loro velocità di sedimentazione.
Si possono preparare frazioni subcellulari o
isolare specifici organelli
Per analizzare una proteina è innanzitutto, necessario estrarla dalla matrice in cui si trova quindi, molto spesso, il primo è un passaggio di
LISI CELLULARE
che avviene tramite: un tampone o l'uso di detergenti e metodi fisici.