Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Analisis DNA hasil PCR dengan Elektroforesis, Kelompok F6 - Coggle Diagram
Analisis DNA hasil PCR dengan Elektroforesis
Alat dan Bahan Elektroforesis
Alat
BioDocAnalyze Biometra
Micropipet
Elektroforesis
Microwave
Bahan
Buffer TAE 1X
Sample hasil PCR
Buffer TAE 10X
Ethidium bromide 20 microgram/ml
Gel yang sering dipakai
Agarose gel
terbentuk dari hidrogen non-kovalen dan ikatan hidrofobik antara polimer gula rantai panjang
Acrylamide gel
memiliki ikatan kovalen bersilangan antar rantai polimernya
Faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi DNA
Temperatur rentang 4- 30℃
Larutan buffer
Tegangan arus listrik
Ukuran DNA
Adanya EtBr dalam gel
Konsentrasi agarosa
Tahap pelaksaan PCR
Tahap pemanjangan (extension)
Terjadi proses sintesis untai baru DNA yang dikatalis oleh enzim DNA Polimerase yang sifatnya tahan panas (thermostable)
Tahap penempelan (annealing)
Pada template pertama diperlukan pemisahan untai DNA double stranded melalui pemanasan
Tahap denaturasi (denaturasion)
Terjadinya pemanasan pada molekul DNA sampai suhu 94 derajat yang menyebabkan yang terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi tunggal
Pengertian
Elektroforesis
ialah suatu teknik yang digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan purifikasi molekul biologis seperti DNA, RNA, dan protein yang prinsip kerjanya adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan pada suatu medium gel yang dialiri medan listrik berdasarkan ukuran berat molekul dan/atau muatan listriknya.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
adalah suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro pada daerah yang spesifik yang dibatasi oleh dua buah nukleotida
Prinsip Kerja
Pemisahan makromolekul berdasarkan perbedaan laju (mobilitas) partikel bermuatan (total muatan,ukuran dan bentuk) yang bergerak dibawah pengaruh medan listrik
-Pemberian voltase (potensial listrik)
-Anoda dan katoda
Bila molekul bermuatan ditempatkan pada medan listrik, molekul-molekul akan bermigrasi ke arah area dengan beda muatan
Fasa diam
Kapiler
Kertas
gel
Gel agarosa 1% tak bermuatan listrik
Pori memungkinkan molekul besar tertahan lebih kuat daripada molekul kecil
Fasa gerak
Makromolekul yang akan dipisahkan (larutan / suspensi)
DNA bermuatan (negative molecules)
Teknik
Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
dilakukan dalam matriks gel polimer berpori yang mengandung campuran buffer
Capillary Isotachophoresis (CITP)
dimana seluruh pita analit bermigrasi pada kecepatan yang sama.Dalam beberapa aplikasi khusus,baik kation atau anion dapat terpisah,tapi keduanya tidak pada waktu yang bersamaan
Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
digunakan untuk pemisahan spesies amphiprotic,seperti asam amino dan protein yang mengandung gugus asam amino dan gugus amina basa lemah
Prosedur Kerja
3.Tuang larutan gel pada cetakan dan dibiarkan hingga dingin selama 20 menit
4.Setelah gel mengeras,sisir dilepaskan dari gel sehingga terbentuklah well. Kemudian gel
bersama cetakan diletakan pada alat.
2.Pasang cetakan beserta sisir dan waterpass,kemudian atur keseimbangan posisi cetakan
dengan memutar sekrup pada bagian kaki cetakan. Pastikan posisi gelembung pada
waterpass tepat berada ditengah.
5.Tuangkan TAE dan TBE pada alat dan gel, hingga semua well dan gel terendam.
1.Buat gel agarosa dengan konsentrasi 1,5% atau 2% dengan 0,6-0,8 gram agrosa dan 40 ml buffer lalu dipanaskan menggunakan microwave.Pemanasan dilakukan sambil diselingi dengan pengocokan hingga
diperoleh larutan gel yang jernih dan ditunggu hingga suam-suam kuku
Buffer yang digunakan adalah buffer TAE 1x yang dibuat dari pengenceran buffer TAE 10x.
M1.V1 = M2.V2
1.200 ml = 10.x
x = 20 ml
Diambil 20 ml Buffer TAE 10x dan 180 ml aquadem lalu dicampurkan
6.Injeksikan sampel dan marker pada well.
7.Hubungkan kabel alat dengan sumber listrik.Tekan tombol ON pada alat.Atur voltase elektroforesis sesuai dengan kebutuhan, kemudian tekan tombol RUN.Apabila proses elektroforesis sudah cukup, tekan tombol off pada alat.Cabut kabel alat dari sumber listrik.
Manfaat Elektroforesis
Mempelajari ovulasi ditingkat molekular
Membandingkan gen homolog dari 2 spesies yang berbeda
Menentukan fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid DNA
Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
Sebagai DNA fingerprint
Mengetahui ada tidaknya gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu
Memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran
Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein, dam aktivitas enzimatik
Mengetahui susunan sekuens berbagai genom
Mengetahui variasi genetik dalam populasi natural dalam alam
Purifikasi atau pemurnian DNA
Penentuan Fragmen DNA
Ukur jarak migrasi marker dan sampel
menggunakan bantuan “rectangle shape”.
Buat perhitungan log panjang DNA dan
migrasi (cm) dari marker
Buat persamaan regresi (y=bx+a) antara log DNA sebagai Y dan migrasi (cm) sebagai X. Tentukan slope dan intercept
Hitung migrasi sampel (cm) dan masukkan ke persamaan regresi sebagai X sehingga dapat dihitung Y (log ukuran DNA)
Konfersikan log ukuran DNA sampel menjadi
ukuran DNA sampel
Persamaan Regresi
y = bx + a
y = Log panjang DNA
x = migrasi (cm)
Kelompok F6
Priska Oktaviani Putri 110121117
Nathasia Holinda 110121171
Josephine Febryana Nugraha 110121172
Anindita Pramesti Herayani 110121193
Nisrinah Nur Amalina 110121229
