Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Amplifikasi DNA dengan PCR, Kelebihan dan kelemahan PCR, ., ., WhatsApp…

- - - - Ekstrak RNA dengan kit ekstraksi, pipet sampel dimasukkan ke dalam tubes mikrosentrifuge. Campurkan lisis buffer yang mengandung fenol, guanidine
    - - Sampel dipindahkan ke kolom spin dan disentrifugasi
    - - Swab yang mengandung virus diletakkan di tubes steril yang berisi media transport virus
    - - Kolom spin di pindahkan ke tubes yang baru dan hasil residu atau filtrat dibuang. Tambahkan wash buffer, lalu di lakukan sentrifugasi kembali
    - - Mengambil sampel dengan cara melakukan swab dibagian nasofaring dan orofaring, swab dimasukan melalui rongga hidung dan secara perlahan didorong menuju daerah nasofaring dan diputar dalam jangka waktu tertentu untuk mengumpulkan sekret yang mengandung sampel
    - - Tubes divortex dan diinkubasi di suhu ruangan
    - - Kolom dipindahkan ke tubes mikrosentrifuge yang bersih dan ditambah elution, kemudian dilakukan sentrifugasi kembali
    - - RNA yang telah dimurnikan dimasukkan ke dalam master mix yang berisi buffer, enzim reverse transcriptase (RT), dNTPs, reverse primer, forward primer, TaqMan probe, dan DNA polimerase, kemudia dihomogenkan dengan vortex
    - - Hasil vortex di masukkan ke dalam plat PCR dengan dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan menggunakan konsep thermal cycler
    - - Dilakukan fluorosensi untuk menentukan sampel teridentifikasi positif atau tidak virus
- - - - Memipet DNA Template 1 μL menggunakan mikropipet warna hijau dan masukkan ke dalam tabung eppendorf yang sama lewat dinding tabung
    - - Mengatur mikropipet 6,5 μL dan mikropipet Nuclease-free Water 6,5 μL menggunakanmikropipet warna hijau ke dalam tabung Eppendorf yang sama lewat dinding tabung
    - - Memipet PRIMER (reverse) 2,5 μL menggunakan mikropipet warna hijau dan masukkan kedalam tabung Eppendorf yang sama lewat dinding tabung
    - - Tabung Eppendorf berisi campuran akhir di Vortex selama 3 detik sebanyak 3 kali
    - - Mengatur mikropipet 2,5 μL dan memipet PRIMER (forward) menggunakan mikropipet warna hijau dan masukkan kedalam tabung Eppendorf yang sama lewat dinding tabung
    - - Menyiapkan PCR Mix dengan cara “Thawing” dengan cara tube diletakan diantara kedua tangan, digosok agar sesuai dengan suhu ruang dan pipetlah PCR mix sebanyak 12,5µL menggunakan mikro pipet warna oranye lalu dimasukkan kedalam tabung Eppendorf yang kosong lewat dinding tabung
- - - - Polymerase Chain Reaction, PCR
      - metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu
      - in-vitro
    - - Amplifikasi DNA
        
        Analisis Kemurniaan DNA
        
        Isolasi DNA
        
        Sampel
        
        Bagian tanaman
        
        Cairan biologis
        
        Sel/jaringan
        
        Analisis Kualitatif
        
        Elektroforesis
        
        Cut by restriction enzmye
        
        Spektrofotometri
        
        (A260/A280) = 1,8-2,0
        
        Analisis Kuantitatif
        
        Spektrofotometri
        
        (A260 x faktor pengenceran x 50) μg/μL
        "Memenuhi syarat, jika > 5 μg/ml"
        
        Elektroforesis Hasil PCR
        
        Analisis Data
        
        Sequencing
        
        Metode PCR
    - - SIKLUS PCR
        
        denaturasi
        
        Suhu 92-95⁰C
        Waktu 1-2 menit
        
        polimerisasi
        
        Suhu 70-72⁰C
        Waktu 30 detik -2 menit
        
        apealing
        
        Suhu 55⁰C (5⁰C <Tm)
        Waktu 1-2 menit
    - - pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
      - menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3' yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA
    - - langkah yang kritis selama proses PCR.
      - Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA.
    - - pengenalan suatu primer terhadap DNA tergantung
        
        panjang untai
        
        konsentrasi primer itu sendiri
        
        banyak kandungan GC
    - - DNA cetakan
      - Oligonukleotida primer
      - Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP),
      - Enzim DNA Polimerase
      - Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
    - - Kontrol kualitas bahan baku dalam produksi obat tradisional dengan DNA fingerprinting dari berbagai tanaman pada beberapa daerah spesifik misalnya daerah Internal Transcribed Spacer (ITS).
      - PCR terutama teknik Reverse** Transcriptase Real Time PCR (RT qPCR) mampu digunakan untuk konfirmasi status apakah OTG, ODP dan PDP terinfeksi oleh SARS-CoV-2 dengan akurat.
- - - - Metode amplifikasi DNA yang cepat dan telaj dapat digunakan untuk mendeteksi virus karena kesederhanaan dan kecepatan serta spesifisitasnya
    - - Reaksi berantai polimerase multipleks mengacu pada penggunaan reaksi berantai polimerase untuk memperkuat beberapa sekuens DNA yang berbeda secara bersamaan. Proses ini memperkuat DNA dalam sampel menggunakan beberapa primer dan polimerase DNA
    - - Alu PCR adalah teknik "sidik jari DNA" yang cepat dan mudah dilakukan berdasarkan analisis simultan dari banyak lokus genomik yang diapit oleh elemen berulang Alu, yang memungkinkan deteksi polimorfisme genetik dan mutasi pada genom manusia dan primata.
    - - Teknik variasi PCR yang menggunakan 2 pasang primer dengan spesifisitas yang berbeda
    - - Real time polymerase chain reaction atau sering disebut quantitative polymerase chain reaction (qPCR), merupakan suatu metode biologi molekuler berbasis reaksi rantai polimerase. Metode ini mendeteksi amplifikasi gen target selama proses PCR berlangsung, tidak di akhir reaksi, seperti pada PCR konvensional.
    - - Reaksi berantai polimerase digital adalah penyempurnaan bioteknologi dari metode reaksi berantai polimerase konvensional yang dapat digunakan untuk secara langsung mengukur dan memperkuat untaian asam nukleat klonal termasuk DNA, cDNA, atau RNA.
- - - - Menimbulkan smears pada hasil
        
        DNA template berlebih menyebabkan
        rantai DNA kembali menjadi double helix
        DNA strand
        
        KCL berlebih dapat menghambat enzim Taq DNA Pomerase
        
        lon Mg berlebih dapat menghambat
        penempelan primer pada DNA cetakan dNTPs berlebih menimbulkan rasio yang tidak seimbang dengan enzim polimerase
    - - A. Hasi amplifikasi tidak jelas/tipis
        B. Produk PCR tidak jelas
        C. Mereduksi jumlah hasil amplifikasi PCR