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Biotecnología y enfermedad humana - Coggle Diagram
Biotecnología y enfermedad humana
INTRODUCCION: En el pasado, los esfuerzos por entender los genes y su expresión se han visto
dificultados por el inmenso tamaño y complejidad del ácido desoxirribonucleico humano
Estas técnicas incluyen, en primer lugar, el descubrimiento de las endonucleasas
de restricción, que permiten la segmentación de enormes moléculas de ADN
Estos enfoques
experimentales y otros han permitido la identificación de secuencias de nucleótidos normales y mutantea
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Uno de los principales obstáculos para el análisis molecular del ADN genómico es el inmenso tamaño de las moléculas implicadas
Dado que cada enzima rompe el
ADN en una secuencia de nucleótidos específica (sitio de restricción)
Especificidad de las endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción reconocen segmentos cortos de ADNdh (4 a 8 pb)que contienen secuencias de nucleótidos específicas.
Esto significa que, dentro de una región corta de
la doble hélice, la secuencia de nucleótidos de ambas hebras es idéntica
Nomenclatura
Una enzima de restricción se nombra de acuerdo con el organismo en el cual se aisló.
La primera letra del nombre procede del género de la bacteria
Una letra adicional indica el tipo de cepa
y se anexa un número (romano) para indicar el orden en que se descubrió la enzima
Extremos «cohesivos» y «romos»
Las enzimas de restricción digieren el ADNdh produciendo un grupo 3’-hidroxilo en un extremo y un grupo 5’-fosfato en el otro
los extremos cohesivos de un fragmento de ADN
de interés pueden unirse covalentemente con otros fragmentos de ADN
. Sitios de restricción
Una secuencia de ADN que es reconocida y cortada por una enzima de restricción se
denomina sitio de restricción. Endonucleasas de restricción rompen el ADNdh
Centenares de estas enzimas están
disponibles comercialmente, cada una con diferentes especificidades de corte
. CLONACIÓN DEL ADN
La introducción de una molécula de ADN extraño en una célula que se está replicando
permite la clonación o amplificación (es decir, la producción de muchas copias idénticas)
A medida que se multiplica la célula
hospedadora, forma un clon en el cual cada bacteria contiene copias del mismo
Vectores
Un vector es una molécula de ADN a la cual se une el fragmento de ADN que se va a clonar.
Los vectores utilizados habitualmente son los plásmidos y los virus.
Plásmidos procariotas
los organismos procariotas típicamente contienen grandes
cromosomas circulares únicos.
El plásmido recombinante puede
introducirse en una bacteria y producir un gran número de copias del plásmido generado
Otros vectores:
el desarrollo de vectores mejorados que puedan albergar con más eficacia segmentos grandes de ADN o expresar genes viajeros en diferentes tipos
así como constructos artificiales como cósmidos y
cromosomas artificiales bacterianos o de levaduras
Genotecas o bancos de genes
Una genoteca (banco de genes o biblioteca génica) es un conjunto de fragmentos de
ADN de restricción clonados procedentes de un organismo
Por el contrario, las genotecas de ADNc
contienen las secuencias de ADN que sólo aparecen como moléculas de ARN
Genoteca de ADN complementario
si un gen codificante de proteína de interés
se expresa a un nivel elevado en un tejido concreto, el ARNm transcrito
Esto permite una expresión
más eficaz y el resultado es la producción de una proteína de fusión.
. Secuenciación de los fragmentos de ADN clonados
Es posible determinar la secuencia de bases de los fragmentos de ADN que se han
clonado
Los avances en la tecnología de secuenciación,
llamados de próxima generación, o de secuenciación profunda, actualmente
. SONDAS
La escisión de moléculas de ADN grandes mediante enzimas de restricción produce una cantidad apabullante de fragmentos
Las sondas se utilizan para identificar el clon de la genoteca o la banda de gel que contiene el ADN diana,
Hibridación de una sonda a fragmentos de ADN
La utilidad de las sondas depende del fenómeno de la hibridación (o renaturalización) en la cual una secuencia de hebra simple de un ADN diana se une a una sonda
La extensión de la hibridación se mide por la retención de radiactividad en la membrana.
Sondas oligonucleotídicas sintéticas
Si se conoce la secuencia de todo o una parte del ADN diana que se quiere aislar, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas de hebra simple
Por el contrario, las
sondas de ADNc contienen muchos millares de bases y su unión al ADN antiparalelo
mutación
Detección de la mutación βS
-globina: puede utilizarse una sonda de
oligonucleótido específico de alelo (OEA) sintética para detectar la presencia de la
Sondas biotiniladas
Dado que cada vez está resultando más cara la eliminación de los residuos radiactivos,
se han desarrollado sondas no radiomarcadas
Anticuerpos
Si no se dispone de información sobre la secuencia de aminoácidos que permitan guiar la síntesis de una sonda para detección directa del ADN de interés
Para identificar la colonia bacteriana que
produce la proteína y, por consiguiente, contiene el ADNc de interés se utiliza un anticuerpo marcado.
TRANSFERENCIA DE SOUTHERN
En primer lugar, se extrae el ADN de las células, por
ejemplo, los leucocitos de un paciente.
En segundo lugar, el ADN se digiere en
muchos fragmentos utilizando una enzima de restricción
Detección de mutaciones
La transferencia de Southern permite detectar mutaciones en el ADN, como grandes
inserciones, deleciones o reordenamientos de nucleótidos
De manera alternativa, la
mutación puntual puede crear un nuevo sitio de escisión, con el resultado
POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE
RESTRICCIÓN
Se ha calculado que los genomas de dos personas cualesquiera no emparentadas entre sí
son idénticos en un 99,5 %. Con 6 000 millones de pb en el genoma humano diploid
La longitud de los
fragmentos de restricción está alterada si la variante altera el ADN para crear o eliminar
Diagnóstico prenatal
Las familias con antecedentes de enfermedades genéticas graves, como un hijo o un
pariente cercano previamente afectado, quizá deseen determinar la presencia de ese trastoerno en el feto.