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第八章 - Coggle Diagram

- - - - （一）目的基因的克隆
      - （二）基因的体外突变
      - （三）DNA和RNA的微量分析
      - （四）DNA序列测定
      - （五）基因突变分析
        
        OE-PCR
  - - - （一）不对称PCR
        
        不对称的是浓度
        
        产生单链DNA
      - （二）反向PCR
        
        对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增
      - （三）逆转录PCR
      - （四）多重PCR
        
        扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断
      - （五）重叠延伸PCR
      - （六）实时定量PCR
        
        主要利用荧光染料和探针进行检测和定量
        
        SYBR荧光染料（ SYBR green Ⅰ)
        
        TaqMan 探针
        
        信号强度与DNA分子总数目成正比
- - - - 定义掌握
      - 分类——II型
      - 限制——外来核酸没有特异的甲基化修饰，会被核酸酶所水解——为了保护自身的DNA
      - 内切酶切的是3-5磷酸二酯键
      - 命名——属名、种名、株名
      - 识别4-8bp且具有回文序列的DNA片段
      - 5'粘性末端——从靠近5的位置切开 3'粘性末端——从靠近3'的位置切
      - 同裂酶
        
        指来源不同，但具有相同的识别序列
        
        同识同切；同识异切
      - 同尾酶
        
        来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端
        
        有一张图没看懂
      - 可变酶
        
        识别顺序中的一个或几个碱基是可变的
      - 应用
        
        DNA重组，(这个地方不太懂)
    - - 分类
        
        DNA聚合酶I
        
        DNA聚合酶III没有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
        
        每一小段冈崎片段本身是在DNA聚合酶III作用下完成复制的。但是冈崎片段之间连接成完整的滞后链，还需要DNA聚合酶I和连接酶的作用下才能完成。
        
        5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
        
        3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
        
        5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性
      - Klenow片段（DNA pol.大片断）
      - Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）
    - - 定义掌握
    - - 以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链
        
        具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA
        
        以DNA为模板，催化合成cDNA双链。
    - - 催化水解去除DNA或RNA 5ˊ-端的磷酸基团
        
        防止载体自身环化连接，提高重组效率
  - - - 表达型载体——为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件
      - 克隆载体——用来克隆和扩增DNA片段的载体、质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA
    - - 定义掌握
      - 把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。
        
        作为克隆载体的质粒应该是松弛型的。表达载体常用严紧型的
      - 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
  - - - 在LACZ基因中插入目的基因
    - - 琼脂糖凝胶电泳
        
        TAE、EB（溴化乙锭、
        
        浓度越高可以分离越小的DNA片段
        
        聚丙烯酰胺凝胶电泳
        
        脉冲场凝胶电泳
        
        分离大分子DNA或者染色体
  - - - 钙离子诱导
        
        其原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性会发生改变。Ca2+又与DNA结合，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。42摄氏度热脉冲，
      - 电穿孔
- - - - 通过在合成型酵母中表达Cre重组酶，使得整个染色体上的重组单元随机发生重复，缺失，倒位，易位。在细胞中因染色体结构的重排导致全细胞基因组水平、转录组水平以及代谢组水平均发生改变，产生多样性的表型，进而大大加速细胞的进化速度
- - - - 接合
        
        细菌和细菌之间，F因子 F+细胞
      - 转化
        
        外源DNA进入细菌内，细菌抓进去的
      - 转导
        
        以病毒为媒介，转入细菌内
      - 转座