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TP biochimie UNamur VT - Coggle Diagram
TP biochimie UNamur VT
TP 4 : BVDV
RT-qPCR
amplifie l'ADN depuis un ARN
hybridation 56°C
colle les amorces
plusieurs cycles (30)
multiplication de l'ADN (2^(30))
élongation 72°C
action de la revers transcriptase
dénaturation 94°C
sépare les brins
efficacité
PCR = [10^(-(1/Pente)) -1] x 100
restriction
endonucléase
extrémité cohésive
extrémité franche
les amorces
DL1For
BVDV 1
DL2Rev
B3For-B4Rev
B5For-B6Rev
BVDV2
caractéristiques du virus
responsable de la diarrhée virale bovine
détection
élisa
un anticorps anti BVDV de capture et fixe attrape BVDV
un antigène mobile associé à une enzyme va venir se mettre sur le BVDV attrapé plus tot
mise du substrat --> libération de lumière
RT-qPCR
extraction virale d'ARN
transcription inverse
PCR
sonde fluorescente
se met sur les brins d'ADN séparés pour ensuite libéré lors de la transcriptase inverse
TaqMan
lié à une amorce quia deux enzymes
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TP 3 : purification enzymes
le lysosyme
se trouve dans les fluides du corps
propriétés antibactériennes
clive la liaison osidique entre le N-acétylglycosamine et le N-acétylmuramique (muramidase)
électrophorèse en conditions dénaturante
faite sur gel de polyacrylamide avec du dodécylsulfate de sodium (SDS)
SDS dénature la protéine
perte de structure et de fonction
séparation uniquement sur la taille
chromatographie
échangeuse d'ions
fixe la molécule sur un gel chargé à l'opposé
élution à concentration croissante en sel --> déstabilise les liaisons --> molécules partent de la plus positive à la plus négative (si le gel est négatif)
rendement
(action totale de la protéine d'intérêt en
fraction
/ activité totale de la protéine d'intéret dans le
matéril de départ
) x 100
activité spécifique
activité totale de la protéine d'intérêt / quantité totale de protéines
activité totale
mU x correction de volume
facteur de purification
activité spécifique fraction / activité spécifique charge
d'affinité
sur tamis moléculaire
TP 5 : métabolisme
role de l'insuline et du glucagon dans le métabolisme du glucose et des lipides
post-prandial
augmentation de l'insuline
diminution du glucagon
fabrication des stocks de glycogène, désincarcération des GLUT, stimule la lipogenèse
quelques heures post repas
diminution d l'insuline
mise en place des stocks de graisses et de glycogène, stimule la glycogénogenèse et la lipolyse
augmentation du glucagon
diabète sucré chez les animaux
accumulation de TAG chez les diabétiques
les acides gras sont réestérifiés dans le foie et sont libérés dans le foie sous forme réestérifiée à faible densité
beaucoup de chylomicrons et de VLDL et HDL
syndrome métabolique
chez la vache
chez le cheval
TP 1 : chromatographie
absorption naturelle de la lumière
permet de déterminer la concentration d'une solution en observant la différence d'intensité lumineuse en fonction de la lumière absorbée par rapport au rayon incident
las acides aminés absorbent dans les ultra-violets --> besoin d'une coloration spéciale
appareils de mesure
colorimètre
spectrophotomètre
loi de beer-lambert
zone linéaire
A et C directement proportionnel
formule : A = E x L x C
C=concentration du test
L=longueur du trajet optique
E=coefficient d'extinction molaire
A=absorbance
zone plateau
pas directement proportionnel --> doit diluer
analyse colorimètre
étalon
composé que l'on connait
connait l'absorbance et les concentrations
compare l'absorbance d'un composé avec cette droit pour en tirer sa concentration
permet de faire la droite d'étalonnage
blanc = tout les réactifs sauf la substance à doser
supprime les potentiels composés parasite
calculs
concentration
C1V1=C2V2
C2=C1/FD
[(Aéch-ABlc) x C x FD] / (Aét-Ablc)
facteur de dilution
V2/V1
tenir compte du facteur correctif
TP 2 : cinétique enzymatique
effet concentration en substrat
augmentation rapide de la vitesse (ordre 1)
arrivée à un plateau (ordre 0)
effet concentration en enzymes
plus [enzyme] augmente, plus la vitesse de la réaction augmente
déterminer le Km et Vm
méthode graphique
KM=axe des X et Vm=axe des Y
Km = Vmax/2 dans la zone linéaire
méthode arithmétique
Michaelis Mentens
V=Vm x (s/Km+s)
Lineweaver-Burk
Km' = Km x [1+(i/Ki)]
présence d'inhibiteurs
réversible
compétitifs
modifie Km
Km plus grand --> plus proche (0;0) sur l'axe des X
droit moins courbée
non compétitifs
modifie Vmax
Vmax plus petit -->plus haut sur l'axe des Y
irréversible