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Optimisation en chromatographie liquide, Solutés - Coggle Diagram
Optimisation en chromatographie liquide
Principe de la chromatographie
La différence de distribution des espèces entre dux phases non miscibles
Phase stationnaire -> fixée sur un support ou constituant elle-même le support
Phase mobile -> fluide se déplace au contact de la phase stationnaire
Le mélange de molécules à séparer est entraîné par la phase mobile à travers la phase stationnaire qui a pour rôle de les ralentir sélectivement
La différence de vitesse d'entraînement -> séparation
Chque espèces moléculaire (soluté) a un coefficient de distribution (K) qui lui est propre
K = Cps/Cpm
Principe de la séparation
Déplacement des solutés est lié au
pouvoir solvant (force éluant) de l'éluant (interactions soluté-éluant)
capacité des solutés et de l'éluant à s'adsorber sur les sites actifs de la phase stationnaire (interactions soluté-adsorbant et éluant-adsorbant)
HPLC
Phase stationnaire : solide (chromatographie liquide/solide;adsorption ou liquide fixé sur un solide chromatographie liquide/liquide; partage), très faible granulométrie contenu dans une colonne = tube inox
Phase mobile : liquide (solvant pur ou un mélange de liquides
Les grandeurs chromatographiques
Grandeur de rétention
Temps de rétention (tR)
-> temps nécessaire au soluté pour traverser la phase stationnaire
Temps mort (tm)
-> temps nécessaire à un soluté non retenu (absence d'interactions pour traverser la phase stationnaire
tm = L/u
L = longueur de la colonne
u = vitesse linéraire de la PM
Temps de rétention réduit
= tR - tm
Volume de rétention (VR)
-> volume de PM nécessaire au soluté pour traverser la PS
VR = TR x D
D = débit en mL/min
VR = Vm + K.Vps
K = coeff de distribution
Vps = volume de PS
Volume mort (Vm)
-> volume de PM nécessaire à un soluté non retenu pour traverser la PS
Facteur de rétention ou capacité (k ou k')
Caractérise la rétention d'un composé
k' = (tR-tm)/tm = (VR-Vm)/Vm -> tR = tm (1+k') = L/u (1+k')
Rapport du temps passé par le soluté dans PS sur le temps passé par ce même soluté dans PM
Indépendant
des paramètres géométriques de la colonne
si k = 0 -> soluté non retenu
Sélectivé ou rétention relative (α)
Mesure la différence de distribution entre
2 composés consécutifs
1 et 2 -> différence de distribution thermodynamique
α = k'2/k'1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)
α = 1 -> pas de séparation
Indépendant
des caractéristiques géométriques de la colonne
Efficacité
Basé sur la théorie des plateaux
Permettre de
Justifier l'identification de solutés au moyen de paramètres appropriés
chriffrer l'efficacité d'une colonne
expliquer l'élargissement des pics
Mesurée par le Nombre de Plateaux Théoriques
N = 16/ (tR/ω)2 = 5,54 (tR/δ1⁄2)2
ω = largeur du pic à la base
δ1⁄2 = largeur du pic à mi-hauteur
Hauteur équivalente à un plateau théorique ( H ou HEPT)
H = L/N
Hauteur réduite
h = H/dp
dp = diamètre de particules
Efficacité en fonction de la vitesse de la PM
L'equation de Knox -> influence de la vitesse de la phse mobile sur l'efficacité de la colonne
h = Av1/3 + B/v + C.v
v = vitesse réduite =udp/Dm
Dm = coeff de diffusion du soluté dans la phase mobile
A, B, C = constantes
A -> l'anisotropie d'écoulement
B/v -> l'influence de la dispersion des molécules du soluté par diffusion longitudinale (gradient de concentration)
C -> la résistance au transfert de masse
Faible débit (asymptote B/v) -> perte d'éfficacité
Fort débit (asymptiote C.v) -> perte d'efficacité
Région intermédiare (A.v1/3) -> efficacité maximale et h minimum
Résolution
Mesurer le degré de séparation entre 2 solutés successifs 1 et 2
Rs = 2 (tR2-tR1)/(ω1+ ω2) = 1,18 (tR2-tR1)/(δ1⁄2 1+ δ1⁄2 2)
Rs < 1 -> résolution est mauvaise
1,25 < Rs < 1,5 -> résolution est acceptable
1,4 < Rs < 1,6 -> résolution est optimale
Rs > 1,6 -> résolution est trop bonne (temps d'analyse long)
Les efficacités mesurées sur les 2 pics sont peu différentes
Les 2 pics ne sont pas totalement séparés
k- = (k1 +k2)/2
Perte de charge (Δp)
= viscosité de la phase mobile (Pa.s), φ = facteur de résistance à l’écoulement
Δ p (Pa), u (cm.s-1), L (cm)
Perte de charge -> difficulté des composés à s'écouler
φ = f(forme des particules, leur répartition granulométrique, de la texture de PS, qualité du remplissage)
φ ≃ 500 pour particules poreuses sphériques
φ ≃ 1000 pour des particules poreuses de forme irrégulière
Capacité disponible (CD)
La quantité de soluté injecté qui provoque la saturation de la PS
CD = Qs/m
Qs = quantité de soluté fixé à l'équilibre (à saturation) par la PS
m = masse de PS contenue dans la colonne
Saturation -> déformation du pic, perte de symétrie et modification tR
Optimisation
Paramètres expérimentaux
Composition de la PM
Débit de la PM
Température
Longueur de la colonne
Nature de la PS
Les caractéristiques physiques de la PS (diamètre des particules, des pores..)
Grandeurs affectées
Facteur de rétention (k') et sélectivité (α)
Efficacité (N)
Perte de charge (pression, Δ P)
Grandeurs observées
Resolution (Rs)
Temps d'analyse
Concentration minimale détectable ou quantifiable (Cmin)
Capacité en picss (nombre de pics)
Optimiser la résolution
k' + -> Rs +
α + -> Rs +
N + -> Rs +
Influence de k'
k' < 5 -> forte influence sur Rs
k' > 5 -> influence tend à devenir négligeable
En pratique
changer la composition ou la nature de la PM
changer la température -> marge de manoeuvre limité car il ne faut pas altérér la PS ni que les solvants passent à l'état de vapeur
changer la nature de PS
Influence de α
α < 4 -> forte influence
α > 4 -> influence tend à devenir négligeable
En pratique : modifie k'
Influence de N
En pratique
Augmenter la longueur de la colonne
Diminuer la HEPT
Optimier le temps d'analyse
Tm + -> temps d'analyse +
En pratique
changer la composition ou la nature de la PM
changer la température
augmenter la vitesse (le débit) de la PM -> altrere l'efficacité -> altérer la résolution
Utiliser une colonne plus courte
Rélation paramètres expérimentaux/grandeurs observées
https://coggle.it/diagram/YnFUW57qHbBk-nBo/t/param%C3%A8tres-physiques-de-la-colonne
Comment faire?
Influence de la phase stationnaire
Le choix de la PS dépend de
Nature des solutés
Poids moléculaire
Solubilité
Caractère ionique, ionisable ou neutre
Caractère hydrophobe ou hydrophile
Conformation stéréochimique
Technique utilisable
Chromatopgrahie à polarité de phases normale ou à polarite de phases inversée
Chromatoraphie de perméation sur gel
Chromatographie d'échanges d'ions
Chromatographie de paires d'ions
Chromatographie chirale
Chromatographie d'adsorption à polarité de
phase normale
Nature de la PS
Gel de silice
grains sphériques
grains irréguliers
monolithes poreux (le polymère de gel de silice est formé d'une seule pièce dans la colonne m6eme)
Gel de silicee = silice hydroxylée plus ou moins hydratée -> risque d'adsorption irréversible sur une silice trop activée -> désactivation par réhydration partielle
Mécanisme de l'adsorption
Phase normal est utilisée pour les composés
solubles dans des solvants organiques
peu polaires (HAP) ou moyennement polaires (phénols, acétates, quinones)
Taille de grains de la silice (-) -> surface sécifique (+)
Polarite de la PM (+) -> froce éluant (+)
Chromatographie de partage à polarité de
phases inversée
Nature de la PS
Silice greffée par des greffons apolaires (chaines carbonées) ou par des greffons faiblement polaires
Diminuer la polarité excessive du gel de silice et son acidité -> utiliser la réactivité des groupements silanols (≡Si-OH) pour fixer des molécules organiques par liaisons
covalents
Réaction de silanisation
Liaisons ≡Si-O-Si≡ -> stables thermiquement et dificilement hydrolysables si 2 < pH < 8
Nature des greffons
Hydrocarbures C1 .. C30, le plus fréquent C18 et C8
Phenyl -> caractère hydrophile léger
Cyano (-CN), amino (-NH2) -> phase normale, polaire
Diol
Tous les silanols ne sont pas greffés (≤ 50%) -> les silanols libre peuvent entrainer une mécanisme de rétention autre (adsorption) ->
problème de sélectivité
Amélioration de la sélectivité
Recouvrement final (end capping) -> substituer les groupements OH résiduels par un traitement avec du triméthylchlorosilane (TCMS)
Caractérisation des PS greffées
Nature et longueur du greffon, chaine linéaire ou ramifiée
Pureté des greffons
Nature de la greffe (liaison par 1 ou par 2 ponts siloxane Si-O-Si)
Taux de greffage -> concentration en greffons par unité de surface ou de masse de silice
Il va y avoir une solubilisation des composés entre les greffons -> le choix de la phase stationnaire se fait de façon à reconnaitre une différence
Mécanismes de rétention
2 mécanismes
Partage des molécules S de soluté entre la PM et la phase liquide adsorbée
En milieu eau/solvant org, les solutés les moins polaires sont exclus de la PM aqueuse et interagissent avec les gréffons apolaires ->
effet hydrophobe
Evaluation du pouvoir hydrophobe : coeff de partage eau-octanol
P = C octanol/ C eau
P (+) -> hydrophobicité (+)
Rélation entre P et le facteur de rétention k
Log k = a log P + b
a et b= const pour un système chromatographique donnée et pour une famille de composés déterminée
Critère de choix de la phase stationnaire
Surface sécifique (200-500 m2/g de silice)
Surface spécifique (+) -> efficacité de la phase (+)
Surface spécifique (+) -> diamètres de pores (-)
Mode de greffage
Test de Tanaka -> comparer la sélectivité et les perforamces des colonnes HPLC
7 substances sélectionnées -> décrire 6 propriétés de PS par 6 paramètres
Capacité de rétention
Hydrophobicité
Sélectivité stérique
Capacité silanol
Capacité d'échanges d'ions (pH 3)
Capacité d'échanges d'ions (pH 7)
Les valeurs de paramètres sont représentées sur les six axes d'un hexagone
Symétrie (+) et surface (+) -> somme de propriétés chromatographiques de PS est plus équilibre
Trouver une phase de remplacement présentant un hexaone le plus ressemblant -> propriétés sont proches
Influence de la phase mobile
Force éluante (ε)
La capacité du solvant à provoquer une diminution de la rétention des solutés
Force éluant (+) -> composé peu retenu -> tr faible
Force éluante faible -> composé très retenu -> tr grand
Solvants le plus courants
non polaires : hexane ou isooctane
moyennement polaires : éther diisopropylique (de préférence), dichlorométhane ou dichloroéthane
polaires : isopropanil, méthanol ou acétonitrile
Intéractions soluté-solvant
Les forces intermoléculaires
Dispersion (dipôle instantané - instantané
Induction ( dipôle permanent - induit
Orientation ( dipôle permanent - permanent)
Les forces de liaison hydrogène et de transfert de charge spécifiques du couple soluté-solvant
Les interactions électrostatiques entre les espèces ionisées
Polarité d'un solvant
La somme des polarité provenant de l'aptitude
à donner des interactions dipôle-dipôle P'xn -> mesuré avec le nitrométhane
xe + xd + xn = 1
à former des liaisons hydrogène du au pouvoir
accepteur de protons P'xe -> mesuré en prenant l'éthanol
donneur de protons P'xd -> mesuré avec le dioxane
En adsorption
PS très polaire, PM peu polaire
Polarite de la PM (+) -> force éluant (+)
En partage
En phase normal
Polarité P'(+) -> force éluante (+)
En phase inverse
Polarité P'(+) -> force éluant (-)
Il faut également tenir compte de la longueur d'onde en dessous de laquelle le solvant absorbe et masquerait le signal des molécules
Sélection des solvants
8 groupes de sélectivité -> aptitude à donner les mêmes types d'interactions -> adjustement des facteurs de rétention
Chromatographie d'adsorption et de partage normal -> alcane ou cycloalcane + I, V, VII
Chromatographie de partage à polarité inversée -> eau + II, III, VI
Modification de la nature et l'intensité des interactions solutés-solvant -> grandes variations de la sélectivité
Si les solvant envisagés ne sont pas miscibles, ils ne peuvent pas être utilisés pour constituer la phase mobile
Optimisation de la sélectivité
Diagrammes en fenêtres
Réaliser plusieurs injections d'une solution contenant les composés à éluer en faisant varier le % d'eau dans la PM
Tracer log k = f(% eau) et =f(%eau) et α=f(%eau) -> déterminer les conditions idéales d'élution
Faire varier la composition de la phase mobile = modifier la proportion des solvants
Bandes de valeurs critiques des facteurs de capacités
ki = valeur désirée
kj = valeur avant optimisation
Obtenir des zones pour lesquelles on s'approche des conditions optimum de composition de phase mobile
Solutés
Forces de rétention
Adsorption du soluté sur l'adsorbant
(intéraction soluté-PS)
Phase stationnaire
Adsorption de l'éluant sur l'adsorbant
Forces d'entrainement
Dissolution du soluté dans l'éluant
(intéraction soluté-PM)
Phase mobile
