五对小鼠（WT和KO）

小鼠摘眼球取血，均分到抗凝管和普通EP管。

摘取胸腺

普通EP管4度过夜放置，次日分离血清

抗凝管外周血

1、检测铁含量

2、检测总铁结合力？

1、生理盐水溶血实验

2、检测两组小鼠血红素含量

3、检测两组小鼠铁卟林含量

1、称重，计算胸腺和体重百分比

2、重新检测胸腺CD3e+、CD4+、
CD8+ T细胞数量和百分比？

脾脏摘取，称重

立即使用研钵研磨，研磨后使用滤网过滤，获得脾脏单细胞 :

1、取一部分离心后加入总铁检测试剂盒相关试剂，检测总铁含量

2、取一部分离心后提取总RNA，可先加入Trizol，冻于负八十度，次日提取，用于RNAseq差异基因表达验证

3、取一部分离心后提取总蛋白，用于检测血红素合成相关蛋白表达

4、检测细胞血红素和铁卟林含量

6、重新检测脾脏CD3e+、CD4+、CD8+ T细胞数量和百分比？使用Counting Beads计数？

7、流式检测TER119、CD71、CD44和Hoches33342

8、流式检测MitoSox、线粒体膜电位（TMRM）、线粒体ROS含量（DHE）

5、分离线粒体，检测细胞线粒体血红素和铁卟林含量

分离全骨髓细胞，滤网过滤，获得单细胞悬液

分离十二指肠

预冷生理盐水清洗内容物

1、取一截固定于中性福尔马林溶液，用于普鲁士蓝染色

2、需要研磨后检测总铁含量和FPN1等蛋白的表达？

9、取一部分离心后加入总铁检测试剂盒相关试剂，检测总铁含量

8、取一部分离心后提取总蛋白，用于检测血红素合成相关蛋白表达

7、检测细胞血红素和铁卟林含量

6、分离线粒体，检测细胞线粒体血红素和铁卟林含量

5、重新检测骨髓CD3e+、CD4+、
CD8+ T细胞数量和百分比？使用Counting Beads计数？

取一部分，Biotin分离Ter119+细胞

2、流式检测TER119、CD71、CD44和Hoches33342

1、流式检测MitoSox、线粒体膜电位（TMRM）、线粒体ROS颔联（DHE）

3、每个样本取至少200万细胞冻存于负八十度，用于细胞代谢组学。分离的线粒体可以做代谢组学吗？

4、取一部分Ter119+固定于预冷的戊二醛，用于透射电镜

数据分析

流式分析：Rbm38敲除后对造血干祖细胞的影响

摘取肝脏

立即使用研钵研磨，研磨后使用滤网过滤，获得肝脏单细胞

5、检测血红素和铁卟林含量

4、取一部分离心后提取总蛋白，用于检测FPN1蛋白表达，肝脏也是血红素合成的重要场所（19%），用于检测血红素合成相关蛋白表达

3、取一部分离心后提取总RNA，可先加入Trizol，冻于负八十度，次日提取，用于检测Hepcidin等指标差异

2、取一部分离心后加入总铁检测试剂盒相关试剂，检测总铁含量

1、取一定体积离心后立即冻于负八十度，用于RNAseq测序。肝脏摘取前是否需要先进行心脏灌注？灌注是否会影响到骨髓细胞分离？

RNAseq结果分析

1、差异基因成图

2、将FDR小于0.05的基因的可变剪切可视化，以及可变剪切差异基因的功能富集

3、WGCNA分析

GEO数据库相关数据分析

将Rbm38课题所有结果整理成可供发表习形式

4、将人的测序数据与鼠的测序数据联合分析

蛋白定量结果是否要催一下？刚好可以将蛋白与RNAseq结果联合分析

称重