การเตรียมอาหารเลี้ยงสาหร่ายเซลล์เดียว
สูตรอาหารที่ใช้เลี้ยงสาหร่ายเซลล์เดียว
ธาตุอาหารรอง (micronutrient) : ธาตุอาหารที่พืชต้องการใช้ปริมาณน้อย เมื่อเติมลงไปจะให้สาหร่ายเจริญเติบโตดีขึ้น
ธาตุอาหารหลัก (macronutrient) : ธาตุอาหารที่สาหร่ายต้องการใช้ปริมาณมากเพื่อการเจริญเติบโต ได้แก่ C N P S K Mg และ Ca
ธาตุอาหารรองอินทรีย์ (organic micronutrient) ได้แก่ คาร์โบไฮเดรต เช่น น้ าตาลเดกซ์โตรส เกลืออินทรีย์ เกลืออะซิเตท ในรูปธาตุ Na K vitamin (B1 B12 และ Bรวม) นิยมเติมหลังผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
ธาตุอาหารรองอนินทรีย์ (inorganic micronutrient) ได้แก่ Fe Mn Ca Zn Cu Co และ Bนอกจากนี้สาหร่ายเซลล์เดียวต่างชนิดอาจต้องการธาตุอาหารเพิ่มที่แตกต่างกัน เช่น สาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงิน ต้องการ Na สาหร่ายไดอะตอมต้องการ Si
วิธีการเตรียมอาหารเหลว
ชั่งสารเคมีส าหรับธาตุอาหารหลักทั้งหมด ละลายน้ำให้ได้ปริมาตร 150 มล. เติมสารละลายธาตุอาหารรอง
ที่กำหนด แบ่งปริมาตร 100 มล. ใส่ flask ปิดปากขวดด้วยอลูมิเนียมฟอยด์ นึ่งฆ่าเชื้อ
ชั่งสารเคมีสำหรับธาตุอาหารรอง ละลายน้ำจนได้สารละลายเป็นเนื้อเดียว ปรับปริมาตรสารละลายตามก าหนด
วิธีการเตรียมอาหารแข็ง
แบ่งปริมาตรที่เหลือจากข้อ 2 (50 มล.) ใส่ flask เติมผงวุ้นให้ได้ความเข้มข้น 1.5% ปิดปากขวดด้วยอลูมิเนียมฟอยด์ นึ่งฆ่าเชื้อ รอให้อาหารเย็นลงประมาณ 55-60 C เทใส่ petri disc ขั้นตอนนี้ท าในตู้ปลอดเชื้อ รอให้อาหารเย็น ท าการคว่ า petri disc เก็บเข้าตู้เย็น
การแยกเชื้อและการทำให้บริสุทธิ์
click to edit
ขั้นตอน
นำสาหร่ายที่แยกได้มาหนึ่งโคโลนีเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์สาหร่ายในหลอดทดลอง เพื่อเก็บเป็นหัวเชื้อสำหรับขยายพันธุ์ต่อไป
สามารถทำได้หลายวิธี เช่น การใช้ micropipette ดูดเอาเซลล์เดี่ยวมาเลี้ยงในหลอดทดลอง หรือการใช้สูตร
อาหาร การเพาะเลี้ยงเซลล์สาหร่ายบนอาหารวุ้น เป็นต้น
การแยกเชื้อหรือเซลล์สาหร่ายเพื่อนำมาเลี้ยงชนิดเดียว (unialgal) เริ่มต้นจากสาหร่าย 1 เซลล์ หรือ 2-3เซลล์ หรือ 1 เส้น (clones)
รออาหารเย็นลงประมาณ 55-60 C เทใส่ petri disc (ทำในตู้ปลอดเชื้อ) รอจนอาหารเย็น คว่ำ petri disc
เก็บเข้าตู้เย็น ทำการเขี่ยเชื้อเซลล์สาหร่ายในสภาพปลอดเชื้อ
เทวุ้นใส่หลอดทดลองที่ autoclave เติมอาหารเหลวและวุ้น 2% ลงในหลอดทดลองขนาด 7 มล. ปิดหลอดหลวมๆ
เพื่อไม่ให้หลอดแตก
เตรียมอาหารแข็ง โดยใช้สูตรอาหารส าหรับเลี้ยงสาหร่ายที่ต้องการปริมาตร 250 มล.เติมลงใน flask ขนาด 500
มล. เติมผงวุ้นให้ได้ความเข้มข้น 1.5-2% ปิดปากขวดด้วยอลูมิเนียมฟอยด์ นึ่งฆ่าเชื้อ
การแยกเชื้อสาหร่าย ด้วยเทคนิคพาสเจอร์ไปเปต
เตรียมอาหารเลี้ยงสาหร่ายในหลอดทดลอง ประมาณ 5 มล.
หยดน้ าสาหร่ายที่ต้องหารแยกลงใน petri disc ใช้พาสเจอไปเปตดูดเซลล์สาหร่ายถ่ายสู่ในหลอดทดลองให้ได้ประมาณ 25
เซลล์ นำไปเลี้ยงในตู้เลี้ยงสาหร่าย
น าพาสเจอไปเปต เผาลนไฟ จนแก้วอ่อนตัว แล้วดึงแก้วออกจากกันเพื่อให้ได้ปลายแหลม จากนั้นใช้ปากคีบหักปลายตรงบริเวณที่ต้องการ
เขย่าหลอดทดลองทุกวันประมาณวันละ 2-3 ครั้ง ประมาณ 2-3 เดือน
การเลี้ยงสาหร่ายในห้องปฏิบัติการและการขยายปริมาตรในถังขนาดใหญ่
การเลี้ยงสาหร่ายในห้องปฏิบัติการ มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างหัวเชื้อบริสุทธิ์ โดยทำการเลือกสาหร่ายเซลล์เดียวมา
เลี้ยงในหลอดทดลอง ต้องเขย่าหลอดทุกวัน 2-3 สัปดาห์ และท าการขยายส่วนหนึ่งไปยัง flask 250 มล.เขย่า flask ทุกวัน 2-3 สัปดาห์ และขยายต่อไปยัง flask ขนาด 1 ลิตร ให้อากาศตลอดเวลาเพื่อเร่งการเจริญเติบโต
การวัดการเจริญเติบโตของสาหร่าย เป็นการวัดความหนาแน่นของเซลล์ หรือ optical density (turbidity) ดัชนีชี้วัดการเจริญเติบโตของสาหร่ายด้านสรีรวิทยาและชีวเคมีเป็นการวัดปริมาณอินทรีย์สารที่เซลล์ผลิตขึ้น ได้แก่C N protein carbohydrate และ lipid เป็นต้น
การขยายสาหร่ายเซลล์เดียวจากจานอาหารสู่หลอดทดลอง
ถ่ายเซลล์ลงเลี้ยงในหลอดอาหารวุ้นที่เทแบบเอียง
นำหลอดอาหารวุ้นเอียงไปเลี้ยงใต้แสงสว่าง 1-2 สัปดาห์ จนเซลล์สาหร่ายเจริญเป็นสีเขียวเข้ม
นำจานอาหารมาส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยายต่ำ เลือกเซลล์บริสุทธิ์มาจุ่มลงในอาหารเหลว ส่องกล้องจุลทรรศน์อีกครั้งเพื่อตรวจสอบว่าเป็นเซลล์สาหร่ายชนิดที่ต้องการหรือไม่ ถ้าใช่ให้ใช้ loop เขี่ยไปเลี้ยงในอาหารวุ้นชุดใหม่ ทำซ้ำจนกว่าจะไม่การปนเปื้อน
เขี่ยสาหร่ายจากหลอดอาหารวุ้นเอียงไปเลี้ยงในอาหารเหลวในหลอดทดลอง ประมาณ 5 มล.ท าการเขย่าทุกวัน 1-2 สัปดาห์
การขยายสาหร่ายปริมาณมาก
เลี้ยงสาหร่ายใน flask โดยท าการเขย่าขวดทุกวัน 1-2 สัปดาห์
เตรียมอาหารเหลวประมาณ 900 มล. ใน flask 1 ลิตร
เตรียมอาหารเหลว 100 มล. ใน flask 250 มล. ท าการเขี่ยเซลล์สาหร่ายจากหลอดทดลองสู่อาหารเหลวใน flask
นำหัวเชื้อสาหร่ายถ่ายลงสู่ flask 1 ลิตร ปิดด้วยจุกสำลี เขย่าให้เซลล์สาหร่ายแพร่กระจายอย่างสม่ำเสมอ และให้อาหารตลอดเวลา ภายใต้แสงประมาณ 1 สัปดาห์
การศึกษาการเจริญเติบโตของสาหร่าย
วัดน้ำหนักแห้ง (dry weight method) สำหรับสาหร่ายที่นับเซลล์ไม่ได้
นับจำนวนเซลล์สาหร่าย โดยใช้สไลด์นับเม็ดเลือด (Haemacytometer)