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Etapas da proteômica - Coggle Diagram
Etapas da proteômica
O micro-organismo frente ao substrato, secreta várias proteínas, dentre elas a proteína de interesse (EXTRATO BRUTO)
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A lise celular é o primeiro passo na extração, fracionamento e purificação de proteínas
As amostras de lisado são preparadas a partir de espécimes biológicos ou células cultivadas por um protocolo personalizado que pode incluir lise celular, fracionamento subcelular, depleção de proteínas de alta abundância, enriquecimento de proteínas alvo, diálise e dessalinização
Após isso é feito a digestão em solução, que envolve a quebra irreversível das ligações dissulfeto por meio de redução e alquilação seguida pela digestão de proteínas em fragmentos peptídicos
Uma abordagem alternativa é primeiro resolver as proteínas por eletroforese 1D ou 2D e depois coletar fatias de gel que contêm a(s) banda(s) desejada(s)
As proteínas nestes tampões de gel são então reduzidas, alquiladas e digeridas
Depois que os peptídeos são extraídos da matriz do gel, os peptídeos são enriquecidos e os sais e detergentes removidos e preparados para análise de espectrometria de massa (MS)
O enriquecimento de peptídeos alvo específicos e a limpeza da amostra são necessários para uma análise bem-sucedida de proteínas de baixa abundância ou identificação de peptídeos modificados pós-tradução
Para estratégias de digestão em solução, as proteínas são desnaturadas com agentes caotrópicos fortes, como uréia ou tiouréia. Esta etapa é seguida ou combinada com redução de dissulfeto usando um agente redutor (DTT)
Os grupos sulfidrila livres nos resíduos de cisteína são então alquilados com reagentes tais como iodoacetamida para prevenir irreversivelmente os sulfidrilas livres de reformar as ligações dissulfeto
As proteínas desnaturadas, reduzidas e alquiladas são então digeridas por endoproteinases como a tripsina, quimotripsina, Glu-C e Lys-C), que quebram hidroliticamente as ligações peptídicas para fragmentar as proteínas em peptídeos
Os métodos de lise baseados em reagentes usando detergentes não apenas lisam células, mas também solubilizam proteínas. Usando diferentes tampões, detergentes, sais e agentes redutores, pode ser otimizada para fornecer os melhores resultados para uma fração de proteína
A proteômica é o estudo em larga escala das proteínas, usualmente por métodos bioquímicos
Esta relacionada com o conjunto de tecnologias, que tem por objetivos separar e identificar proteínas em amostras biológicas complexas
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