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PCR Qualitativa :check: :green_cross:, Varianti della PCR, Interazioni DNA…
PCR Qualitativa :check: :green_cross:
:one: Controli :construction:
:heavy_plus_sign: :heavy_minus_sign:
Standard interno
:two: :forbidden: inibitori della
Taq Polimerasi
Solventi organici
Metaboliti 2° :evergreen_tree: :sunflower:
Eparina
Sali biliari e bilirrubina, residue porfici dell gruppo HEME
SDS
Urea
Proteasi
Sali di guanidina
Polisaccaridi
Melanina
:three: Tipi
PCR semi-quantitativa :arrows_counterclockwise:
PCR competitiva :signal_strength:
eterologo
omologo
Real Time PCR
Varianti della PCR
Altri varianti
PCR assimetrica
:eight_pointed_black_star: Random aplification of polymorphic DNA (RAPD)
:eight_pointed_black_star: Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
:eight_pointed_black_star: Allele Specific PCR (ASPCR)
:eight_pointed_black_star: Multiplex PCR
:eight_pointed_black_star: Long PCR
:eight_pointed_black_star: Differential Display PCR (DD-PCR)
:eight_pointed_black_star: PCR in situ
:eight: :question:: Rapid Amplified of cDNA ends (RACE 5'/3')
Rapida amplificazione delle estremità 5' del cDNA
Rapida amplificazione delle estremità 3' del cDNA
:nine:Clonnagio del prodotto di amplificazione :man-with-bunny-ears-partying:
Multipli opzioni
:small_orange_diamond: Clonnaggio in vettore T/A con estremità appiccicose
:small_blue_diamond: Clonaggio in vettore T/A con estremità piatte
:small_orange_diamond: Uso di primer contenenti siti di restrizione aggiunti alle estremità 5
:large_blue_diamond: Clonnagio del prodotto di amplificazione con Topo TA vector
Vettore con la topoisomerasi
legate covalentemente +
Prodotto di PCR
dove la Taq pol ha lasciato una A sporgente all'estremità 3' dei prodotti di PCR, che può essere usata per il clonaggio
La topoisomerasi catalizza il
legame covalente
del vettore con il prodotto di PCR
Il vettore covalentemente chiuso è
pronto
per la trasformazione nei batteri
:one: RT-PCR-
mRNA
:two: Random primers
mRNA, tRNA, rRNA, miRNA, siRNA, etc
:three: Nested PCR
:top: sensibilità
:five: Colony PCR :knife_fork_plate: :scissors: : :bulb:
:six: Assembly PCR :video_game: :desktop_computer: :thermometer: :small_red_triangle:
:seven: Degenerate PCR :arrow_backward: :female-construction-worker::skin-tone-4:
:four: PCR inversa :scissors: + :heavy_multiplication_x: :repeat:
Interazioni DNA-proteina
:one:Mappatura dei siti di ipersensibilità alla DNasi I
Saggio con DNasi I e senza, comparazione dei due pezzi
:two: Anatomia di un gene
Domini di legame al DNA.
FATTORI
TRASCRIZIONALI
Zinc finger
Leucine zipper
Heliz loop helix
Helix-turn-helix
PROMOTORE
Promotori possono iniziare la trascrizione in sistemi oociti,, sistemi di transfezione, sistemi transgenici, sistemi
in vitro
:small_orange_diamond: Nucleo del promotore (INR + TATA BOX)
:small_blue_diamond: Promotre prossimale (elementi basali, elemento di rispposta + elementi specifici per il tipo celulare)
:small_orange_diamond: Promotore distali (elementi di risposta + elementi specifici per il tipo cellulare)
:small_blue_diamond: Enhancer / silencer
Definite sulla base della loro capacit}a di iniziare la trascrizione in sistemi oociti, sistemi di transfesione , sistemi transgenici, sistemi in vitro
:three:Id de una regione promotore
:ONE: Banca dati
:two: Screening Libreria genomia
Cosmidi (Cos sites + pezzi del DNA genomico + vettori di phago Lamda + E coli )
Phagi (Dna genomico + phagico tagliato e ricombinanto)
:four:Identificazione del sito di inizio della trascrizione
mediante RACE
Differenti primers che si appaiano allo stampo, alcuni si appaiano corretamente e danno un construtto utili e altri no
:one: :check: :two: :check: :three: :red_cross:
mediante RNase protection Assay
Si fa iil saggio per duplicto. Un pozzeto sonda+
dna target
e l'altro sonda+ target (duplex + RNasi { che taglia la parte sporgente del sonda, quella che non si appaia
con il mRNA a studiare)
:five: Promotori
Gene reporter
b galactosidasi
b-glucuronidasi
Luciferasi
vettore pGL3-basic + pRL-SV40
:green_heart: GFP
CAT
Analisi di promotori
Nucleasi Bal 21 (+ enzima A che lineariza+ Bal21 + Enzima B che lisa parte Verde e produrre estrmit}a picciocose
Esonucleasi III = (Enzima A sporgente a 5', enzima B sporgente a 3'), Eso III rimuovve da 3' rientrato- S1 rimuove sporgenti + ligasa
Fattori di trascrizione e la loro attività + analisi
in silico
I confini di un promotore sono determinati mediante analisi delezionale
Analis elementi responsivi
Overespressioe del fattore trascrionale
Interferenza dell'attivita del promotorew mediante DECOY
Costrutti conttenenti elementi di sequenza ripetuti in tandem
attivazione trascrizionale indotta dalla overespressione di SREBP-1
Mutagenesi dell'ellemento responsivo,
:six:Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Gel- retardation assay
Si marca (una o entrambe le estremità) un frammento di DNA che si ritiene sia legato da un fattore trascrizionale, esso constituisce la sonda (probe)
Si esegue una reazione di Binding
in vitro
incubando il DNA marcato (probe) con le proteine
I complessi DNA-proteina sono separati dalla sonda libera (free probe) su gel di policrilammide non denaturante poiché hanno mobilità elettroforetica più bassa
Si possono fare di
saggi di competizione o
con sonda mutata
Supershift (+ anticorpo diretto contro FT di interesse)
:seven: Mutagenesi linker scanner
:eight:Seleccionare proteine che si legono al DNA
Promoter Pull-down (+ agarosa e :cyclone: )
ChIP Assay + ChIP on Chip :check: COntrol : PCR su DNA input :no_entry: Control PCR su ImmunoPrecipitatto con IgG aspecifici + PCR su DNA IP ma con coppia primer diretti su altra regione non legata da proteine di interesse)
Cromatografia per affinità per la purificazione di proteine che legano le sequenze promotore
:nine:Metodi di footprinting
Analisi di interferenza
:small_orange_diamond:Methylation interference assay
Se la regione di legame della proteina e metilata, non si puo legare . Gli spazzi che non si vedono nel gel sono asociatte alle sequenze dove si lega la proteina
Analisi di protezione
:small_orange_diamond:Permettono di definire (
in vitro ) il sito di legame analizzando la protezione o la differenza in reattività nei riguardi dell’agente di taglio che la proteina determina sul DNA.
:small_orange_diamond: DNasi H :cry: ingombro sterico
:small_blue_diamond: DMS + piperidina
:one: :zero:Gli aptameri
Selex : Selection of functional nucleic acids (frammenti di DNA + selezione di frammenti di DNA con sequenze funzionali attraverso il legame con la proteina bersaglio e eliminazione dei frammenti di DNA non legati+ PCR + repeat :repeat:)
Gli acidi nucleici sono in gradp di assumere una struttura tridimensionale che permette loro di interagire con specificità anche con altre macromolecole (proteine)
g-quartet
Gli aptameri sono oligonucleotidi ad RNA o DNA capaci di riconoscer una sequenza specicifica aminoacidica o un epitopo appartenente ad una proteina
Potenziale terapeutico :hospital: :check: Non immunogenici, agire target EC come antagonisti, sono funzionalizzati o legati a molecole di riconoscimento :red_cross: Breve vita media per filtrazione renale e difficoltà di penetrazione di membrane biologiche
VEGF . maculopatia + Bcl2 in B-linfomi e Nfkb + Chemokin 12 in linfoma di non-hodgkin
Biologia Molecolare PCR
:one: Che cosa è? :thinking_face:
:hammer_and_wrench:Una tecnica applicata nella :female-scientist::skin-tone-4:ricerca di base, in :hospital:diagnostica e in :hocho: ambito forense
:gear: Si basa sulla amplificazione :signal_strength: di specifici frammenti compresi tra le estremità 5' di due primer definiti.
Attraverso la reiterazione :arrows_counterclockwise: di :hash:N cicli ciascuno dei quali include:
denaturazione :icecream:
appaiamento :woman-with-bunny-ears-partying:
estensione :heavy_multiplication_x:
:first_place_medal: La reiterazione automatizzata della procedura :repeat_one:
:second_place_medal: Le alte temperature di esercizio :fire:
:third_place_medal: La possibilità di definire esattamente la sequenza da amplificare :pushpin:
:sparkler: Conferiscono alla
PCR
: grande sensibilità :sunflower:, specificità :dart: e versatilità :dancer::skin-tone-4:
y=2(e)n :signal_strength:
:two: Sensibilità della PCR :sunflower:
:check: La seletività della PCR
( :star: datta per la scelta dei primer)
conferiscono una elevata sensibilità a partire de
una picola quantità di DNA stampo :printer:
:check: Può funzionare a partire da preparazioni di DNA non purificate :footprints:
:three: Applicazioni :iphone:
:small_orange_diamond: Colony PCR (Colonie Pos di quelli Neg)
:small_blue_diamond: Medicina Forense :female-police-officer::skin-tone-2: :male-detective:
:small_blue_diamond: DNA estratti in reperti fossili :skull_and_crossbones:
:small_orange_diamond: Tecniche di ingegneria genetica :hammer_and_pick:
:small_orange_diamond: Diagnostica molecolare :hospital:
:small_blue_diamond: Evoluzione molecolare :fish: :monkey: :man:
:small_blue_diamond: Scienze ambientali :deciduous_tree:
:four_leaf_clover: La TAQ
DNA polimerasi + Fedeltà di sintesi :star2:
DNA polimerasi termostabile da
Thermus aquaticus
:fire:
Temperatura optima di 72°C :sun_with_face:
quindi resiste alle alte temperature usate negli step di denaturazione :icecream:
Altre DNA pol isolate da
Thermus flavus
= TFL pol
Thermus thermophilus
= TTH pol
Tasse di errore di alcuni DNA pol termostabili :fire:
Taq [1,1
10(-4) - 8,9
10(-5) ]
Vent [2,4
10(-5) - 5,7
10(-5) ]
Thermococcus litoralis
Pfu [1,6
10(-6) ]
Pyrococcus furiosus*
Pwo [3,2
10(-6) ]
Pyrococcus wosei*
:small_orange_diamond:Attività proofreading :arrow_lower_right: tasso d'errore a 10e(-9)
:small_blue_diamond: La TAQ pol è priva di attività proof reading : tasso d'errore a 2x 10e(-4)
:small_orange_diamond: Esistono in commercio DNA pol termostabile + attività proofreading : tasso d'errore a 1,6 x 10 e(-6)
:four: Allestimento della PCR :spiral_note_pad:
Stampo
Buffer PCR
dNTP's (mix)
:red_cross:Se la [primer] è elevata :elephant: la PCR puo produrre:
di prodotti aspecifici
dei dimeri di primer
riduzione di amplificazione dil DNA bersaglio
:check:Se la [primer] è basa :ant: la PCR puo determinare una maggiore stringenza delle condizioni di amplificazione e una maggiore specificità
MgCl2
:flags:La [Mg2+] influisce su:
l'anneling dei primer
Tm del DNA target
specificità di amplificazione
Primers 1+2
Taq Pol
:check:Una maggiore :elephant: quantità di Taq Pol determina una maggiore produzione del prodotto :smiley:
:green_cross: ma allo stesso
tempo si possono ottenere degli amplificati aspecifici :cry:
H2O
:warning: Ghiaccio :snowflake: + cappa a flusso laminare :camera: + micropipete adibite per la PCR + sistemi di protezione per le micropipette
:five: Variabili della PCR :twisted_rightwards_arrows:
:small_orange_diamond: Temperatura
di anneling
dei primer :thermometer:
:check:Una delle fasi più critiche nella ottimizzazione della specificità nelle reazioni di amplificazione
:checkered_flag: Se la temperatura di anneling non è corretta può determinare l'amplificazione di prodotti aspecifici
:checkered_flag: Effettuare di prove in parallelo
:check: Varia a seconda della composizione nucleotidica dei primer : 2 x (A+T) + 4 x (G+C) = :thermometer: T.a. (~55-65°C)
:small_blue_diamond: Additivi :beer:
:heavy_plus_sign:L'agiunta di additivi può determinare una maggiore efficienza :stars: e specificità :dart: della DNA pol
:black_small_square:Glicerolo
:white_small_square:Formamide
:black_small_square:DMSO
:white_small_square: Betaina
:black_small_square: BSA
:small_blue_diamond: Scelta dei
primer :fast_forward: :arrow_backward:
:straight_ruler: Lunghezza dei primer tra 18-24 nt
:thermometer: temperatura di anneling
2 x (A+T) + 4 x (G+C) = :thermometer: T.a. (~55-65°C)
:couple: Che le coppie dei primer adoperate abbiano valori di Tm comparabili (~5°C)
:red_flag: Se possibile, le sequenze dei primer devono terminare con G o C
:forbidden: Non devono contenere sequenze auto-complementari (
forcina
) ne complementari tra di loro (dimeri)
:desktop_computer: Blast per verificare che non vi siano similarità con sequenze ripetitive
:pencil2: :triangular_ruler: Primer desing with online tools like BibiServ2, Primer3web, PrimerQuest, OligoAnalyzer Tool
:six: Fase di plateau della PCR :knife_fork_plate:
Disattivazione della TAQ pol
Consumo dei substrati nucleotidici
Consumo dei primer
Inibizione da parte del pirofosfato (DNAn + dNTP = DNAn+1 + PP)
Riassociazione del DNA amplificato
:seven: Problemi connessi con la PCR :!?:
:biohazard_sign: Contaminazione (Carry Over) : quando alcun elemento della PCR è contaminato con il DNA stampo :printer:
:red_cross: Aspecificità : quanddo a causa della elevata sensibilità della PCR può dare falsi positivi
:black_small_square: in presenza di genomi complessi
:white_small_square: temperature poco stringenti
:check: Possibili rimedi
:small_orange_diamond: Set di micropippete solo per la PCR
:small_blue_diamond: Uso di puntali dotati di filtro che bloccano le
goccioline
di aerosol
:small_orange_diamond: Uso di guanti
:small_blue_diamond: Lavorare in ambienti adibiti per la PCR e sotto cappa
:small_orange_diamond: Aliquotare i componenti della PCR
:check: Possibili rimedi
:small_blue_diamond:
HOT start PCR
(enzima viene aggiuanta per ultimo alle elevate temperature)
:small_orange_diamond: Barriera fisica mediante l'uso di paraffina o cera
:small_blue_diamond:
Complesso polimerasi /anticorpo a-pol
che viene disattivato alle elevate temperature liberando l'attività enzimatica
Epigenesi
:seven: Analisi del DNA metilato mediante arrichimento per affinità
Utillizza anticorpi che riconoscono le citosine metilate o anticorpi specifici per le proteine che legano il DNA metilato
:check:Informazione rapida della metilazione del DNA a livello genomico
:forbidden: Non forniscono informazioni sui singoli CpG
:one:Metilazione delle citosine
coppia CpG, enzima DNA metil-trasferasi + Metilo nel solco maggiore del DNA
Isole CpG vicini alla regione promotore dei geni e la loro metilazione comporta l'inattivazione dell'espressione del gene
:three:Epigenomica + DNA metilito mediante digestione con endonucleasi
MspI :scissors: DNA + DNA+ met
HpaII :scissors: DNA
:two:Modificazione covalente degli istoni
Sia nella estremità -COOH o nella estremità -NH2
Acetilazione, SUMOlationze, Ubiquitinazione, Biotinilazione, Methylation, Citrulation, ADP-ribosilation, Phosphorilation, cis-trans isomerization
:five: Arbitrarily primed PCR (AP-PCR)
Methylation-sensitive arbitrarily primed PCR ( lo stesso di prima + siti di restrizione di HpaIII vs MspI )
Primer che non si appaia di manera perfetta, la regione complementaria non c'è nel genoma normale o controllo
:six: Analisi del DNA metilato mediante trattamento con bisolfito
Whole-genome shotgun bisulfite sequencing (bassa complessità)
Basato Sul fatto che il bisulfito cambia chimicamente più rapide de
citosine non metilate a uracilo
:four: Restriction Landmark Genome Scanning (RGLS)
Le differenze in metilazione vengono rilevate come differenze nei profili di restrizione generati tramite digestione con una enzima di restrizione metilazione sensibile separata tramite elettroforesi bidimensionale
Genome editing
:three:Nucleasi a dita di zinco (ZFN) :hand::skin-tone-3:
endonucleasi Fok I
{DNA binding domain :warning: si rimuove per un motivo a dita di Zinco :rocket: DNA cleavage domain }
ssBreak
Legame coordinato da 2 histidine + 2 cystine
{alfa elica che interagisce con 3 base azotate} + beta foglia legame con l'altro dita
Per avere un DS break devono legarse 2 x ( Enzimi Fok 1 con il dominio di legame al DNA cambiate per uno a dita di ZInco)
:forbidden: Non tutti i sitti sono adatti per il legame delle ZFN
:check: Maggiore facilità
in vitro
:one:Che cosa è?
Si intende l'uso di tecniche di ingegneria genetica che generano una modificazione sito-specifica nel genoma nelle cellule mediante nucleasi ingegnerizzate
La modificazione è permanente, per cui può essere ereditaria
Per modificazione sito-specifica si intende la possibilità di effetuare il silenziamento di un gene
knock out
attraverso la sostituzione di alleli corretamente funzionanti con i correspondenti mutati.
Viceversa, con la stessa tecnica è possibile correggere una mutazione in un allele genico alterato, convertendolo nella sua forma funzionale
Elemento chiave del genome editing è la introduzione mirata di una rottura a doppio filamento nel DNA (dsBreak)
:four:SIstema TALEN
Dominio C-terminale responsabile dell'attivazione della enzima (in questo caso anche Fok I
Un lungo dominio centrale di legame al DNA, costituito da numerose ripetizioni amminoacidiche consecutive.
Ogni ripetizione
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amminoacidi, sono identiche tra loro, tranne che per i residui in posizione 12 e 13 denominati "repeat-variable diresidue)
:forbidden: difficoltà di creare questo sistema
in vitro
:five: CRISPR/Cas
Repeats (sequenze ripetute altamente conservate :woman-with-bunny-ears-partying: ) + spacers (dimensioni simili ma diversi tra di loro :baby: :vs: :older_woman:)
Sistema immunitario ( :shield: contro phaghi e plasmidi) adattivo ( :star: perché il batterio acquista spaziatori in seguito ad ingresso del materiale genetico estraneo e diventa più resistente a nuovi attachi) , ereditabile :signal_strength: :baby_chick: :chicken: perchè il genoma cambia in seguito, quando il batterio si divide, le due cellule figlie sono già resistenti a determinati attachi
Locus CRISPR
Array PCR (spacer + repeats)
sequenza leader a monte dell Array CRISPR, contenente una regione promotore
I cluster di geni cas (Crispr Associates )
Classi
Clase I :
Sistemi tipo - I Hanno sequenze palindromiche pre.crRNA, strutture a forcina. Cas6 :scissors: taglia a la base della forcina generando i crRNA maturi
Sistemi tipo - III Pre-crRna tagliato :scissors: da Cas6 liberando crRNA che però non sono ancora maturi > essi vengono legati e ulteriormente processati da un grande complesso ( CMR) ¨complesso multiproteico che grazie al crRNA individua RNA estranei e non DNA)
il complesso effettore dei sistemi CRISPR/Cas di Classe 1 sono constituiti da numerose subunità.
Clase II:
Sistema tipo
II
il complesso effettore dei sistemi CRISPR/Cas è
costituito da una grande proteina (CAS 9) che riconosce e taglia
Per la maturazione del pre-crRNA è necessaria l'RNasi III
(gRNA, guiidance RNA = crRNA (parte constante che è complementaria al tracrRNA e una parte variabili appartenente alla sequenza spaziatora + tracrRNA {necessario per la maturazione del crRNA, transattivante-crRNA- pezzo constante}
:one: targeting: Cas9 + gRNA individua i bersagli tramite collisione. identifica un sito
PAM
Protospacer Adjacent Motif: e interroga il DNA adiacente per testare la complementarità all gRNA. Questo Pam si localizza nella sequenza non bersaglio
:two: Svolgimento DNA target. In seguito avviene lo svolgimento del DNA target a monte della sequenza PAM, e la sequenza bersagio si complementa con la sequenza variabile del gRNA
:three: Dopo lo svolgimento, il DNA target viene tagliato 3 bp a monte della sequenza PAM
:six: CRISPR/Cas) nel genome editing :pencil2:
:forbidden: scarsa efficenza di traduzione (codoni diversi tra euk e Prok) :check: riduzione del numero dei componenti. Semplificazione del locus CRISPR,, mediante il disegno di un gRNA, chiamato sgRNA in cui la sequenza crRNA e quella del tracrRNA sono fisicamente unite attarverso un lloop. e non e piu necessario la RNasi III
:construction_worker::skin-tone-2: Varianti di Cas) che non tagliano il DNA chiamate RuvC e HNH
:scissors: :scissors: Cas9 con un solo sito catalitico. Inquesto caso occorre individuare due siiti distinti sul genoma, ciascuno di essi su un filamento del DNA distinto e distanti fra loro. Il tratto di DNA compreso fra i due siti di taglio viene rimosso, e il taglio può essere riparato o per NHEJ o per HDR
:two: Risoluzione di DS.break :scissors:
Ricombinazione diretta dall'omologia (HDR)
Homology
Direct Recombination
:black_small_square: Knock out
:black_small_square: Correzione puntiforme di una mutazione
Giunzione non omologa delle estremità (NHEJ)
Non homology End Joints
:black_small_square: Knock Out :boxing_glove:
PCR Quantitativa :heavy_plus_sign: :heavy_minus_sign: :heavy_multiplication_x: :heavy_division_sign:
Determinazione dei livelli di mRNA
Basate sull'amplificazione mediante PCR
PCR semi-quantitativa
PCR competitiva
Quantificazione relativa
:small_orange_diamond: Rapporto normalizatto
(RN)
:one: (DO gene Target in cellula trattata)
:two: (DO gene Standard in cellula Trattata)
:three: DO gene target in controlo
:four: DO gene standard in controllo]}
Analisi della Melting Curve con Sybr Green I
Basate sull'ibridazione di sonde
northern blotting
ribonuclease protection assay
Real Time PCR
Efficienza della PCR
Cinetica
Efficenza = 10 ^ (-1/slope)
100% = 2,00
90%= 1,90
80% = 1,80
70% = 1,70
Dopo n cicli [DNA]f = [DNA]i*(Efficenza)^n
Quantificazione in Real Time PCR
:Large_orange_diamond: Assoluta :small_red_triangle: Curva Standard- extrapolazione
:large_blue_diamond: Relativa
:small_blue_diamond: Curva Standard (diluzioni di [cDNA target :dart: e di cDNA controllo :construction:]
Rapporto Normalizzato
:small_blue_diamond: Valori Ct
Metodo di Pfaffl
Metodo del 2 :small_red_triangle: :small_red_triangle: Ct
:black_circle: Quencher
:zap:Fluorescente
attività nucleasica del TAQ pol
SYBR green :green_heart: :books: Elongamento
TAQ MAN :purple_heart: :books: Anneling, Elongamento
Sitema sonda-ibridazione :yellow_heart::
Fluorescense Resonance Energy Transmission
:books: anneling
Molecular beacons :blue_heart: :books: denaturazione
:small_orange_diamond:Linea soglia
:small_blue_diamond:RFU
:small_orange_diamond: Variabilità della PCR
:small_blue_diamond: Linearità
Pfaffl:
(E target)^[Ct controllo - Ct exp]
(E riferimento)^[Ct controllo - Ct exp]
Digital PCR
Quantifica di manera assoluta
Piccole goccioline ogniuna con >=1 stampo
-ln [1-event positivi/eventi totali)]
PCR semi quantitativa
Standard Interno :trophy:
Sappere la variazione (# di volte o %) di cambio nel contenuto del cDNA nell esperimento vs le condizioni di controllo :cyclone:
PCR competitiva :checkered_flag: :car: :blue_car:
Due stampi amplificabilie con la stessa coppia di primers (Competitore :signal_strength: vs Target :scales:
Rapporto Target/Competitore =1 a quella [Competitore] = [target]
Competitore è amplificato per la stessa coppia di primers ma produrre un prodotto diverso sia in
:small_orange_diamond: dimensioni / peso
:small_blue_diamond: pattrone di taglio de una enzima di restrizione :scissors:
Tipi di competitore
:small_red_triangle: omologhi : quando sono quasi la stessa sequenza tranne un pezzo (sia deleto, sia aggiunto)
:small_red_triangle: eterologhi hanno una sequenza nucleotidica diversa tranne la regione dove si appaiano i primers
Mutagenesi
Sito-specifica :pushpin:
::two: :gear: Tecniche con Overlapping PCR
Delezione
Adizione
Mutazioni multiple
Sito Specifica
:Tutti + PCR INVERSA
:four: tecniche con Fago M13
:-1::skin-tone-3: Problems :anger:
Metodi di selezione dei filamenti con la mutazione
Filamento con fosfotioato
Mutagenesi con il metodo Kunkel ( :no_entry:
dut
( :arrow_up: [uracilo] ) +
ung
( no :warning: per rimuovere Uracilo di DNA)
:three: :check: Tecniche con Megaprimer
Mutagenesi Quick Change
Il frammento da mutare è clonato in plasmide (estratto da un ceppo di
E.coli
dam+
[che metila l'adeninda della sequenza GATC] Il plasmide è usato come stampo in una reazione di PCR con due prier sovrapposti e complementarii, ciascuno dei quali contiene la mutazione desiderata , si effettua una digestione con
DpnI
che taglia il DNA metilato di origine batterica che sarà in degrato (il DNA di nuova sintesi non è metilato). Si effetua la trasformazione in
E.coli
del plasmide mutagenizzato
Random :game_die:
:seven: DNA shuffling. Evoluzione guidata
in vitro
:small_blue_diamond: omologia genica: Sembrano lo stesso gene ma con piccole differenzze.
:small_orange_diamond: gene ortologhi (different species, same gene, from same common ancestor)
:small_blue_diamond: geni paralogi: (lo stesso gene, nella stessa specie con piccole difference tra di loro)
:six: Random mediante PCR con Mn al posto di Mg e sbilanciato per uno dei 4 dNTP A vs tcg
Semi Random :pushpin: :world_map: :game_die:
:five: Semi random a cassetta
:ballot_box_with_check: Inosina
:red_cross: siti di restrizione unici ai latti della regione a modificare
:red_cross: Alto numero di oligonucleotide a sintetizzare
:one: introduzione di diversi base nucleotidiche, sia aggiungendo, sia eliminando
