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REPLICAZIONE DEL DNA, G1, S, G2--> interfase (periodo di crescita che…
REPLICAZIONE DEL DNA
Ciclo cellulare
la durata del ciclo cellulare varia da cellula a cellula
una cellula si divide per permettere la riproduzione, per permettere l'accrescimento corporeo o per rimpiazzare altre cellule
serie ordinata di eventi che porta alla divisione cellulare
è costituito da diverse fasi
(G1, S, G2, M)
fase M
--> divisione del nucleo (condensazione della cromatina, sono resi visibili i cromosomi che sono presenti in duplice copia come cromatidi fratelli, essendo già avvenuta la duplicazione)
fase S
--> duplicazione del DNA
3 modelli
conservativo
--> doppia elica parentale intatta + copia totalmente di nuova sintesi
dispersivo
--> ogni filamento di entrambe le molecole figlie ha una miscela di segmenti vecchi e nuovi
semiconservativo
--> ogni doppia elica è costituita da un filamento parentale (stampo) e un filamento di nuova sintesi
esperimento di
Meselson e Stahl
fecero crescere dei batteri per molte generazioni in terreno con
15N
(isotopo pesante dell'azoto) e li trasferirono poi in un terreno con
14N
per una o due generazioni
ogni volta il DNA fu estratto dalle cellule e
centrifugato all'equilibrio di densità in cloruro di cesio
dopo una generazione, trovarono molecole di DNA ibride (con densità intermedia tra quella del DNA-15N e quella del DNA-14N)
modello semiconservativo era quello corretto
diversa in
procarioti
presentano un
DNA circolare
la replicazione inizia da una
singola origine
e procede in modo
bidirezionale
lungo il DNA circolare, mentre le due forcelle di replicazione si muovono in direzioni opposte
durante il processo, si formano strutture intermedie, simili alla lettera greca teta (
replicazione teta
)
le due copie di DNA sono ancorate alla
membrana
in corrispondenza della loro origine di replicazione e mentre la cellula cresce è aggiunta altra membrana plasmatica tra i due cromosomi in modo tale da spingerli ai poli della cellula-->
divisione--> due cellule figlie identiche alla cellula madre
le origini di replicazione reclutano proteine che innescano
denaturazione e replicazione del DNA
DnaB
--> è un'
elicasi
che accoppia l'idrolisi dell'ATP alla denaturazione dei filamenti di DNA durante la replicazione
DnaC
--> trasporta il DnaB per legarlo all'oriC
DnaA
--> si lega ad oriC e denatura il DNA
eucarioti
DNA lineare
la replicazione inizia da origini multiple lungo il DNA da cui si generano più unità di replicazione, dette
repliconi
(utili per velocizzare la replicazione negli eucarioti che altrimenti sarebbe molto lenta)
ogni replicone si attiva in un momento specifico
ai punti di origine si formano le
bolle di replicazione
che poi crescono al procedere delle forcelle di replicazione lungo il DNA in entrambe le direzioni rispetto all'origine
quando le singole bolle si incontrano, si fondono e quando la forcella di replicazione raggiunge l'estremità della molecola di DNA, si forma una
struttura a Y
quando tutte le bolle si sono fuse, la replicazione è completa e le due molecole figlie si separano
anche qui le origini di replicazione reclutano proteine che innescano
denaturazione e replicazione del DNA
complesso di pre-replicazione o pre-inizio
costituito da
ORC, MCM e i caricatori dell'elicasi
complesso MCM
--> proteine di mantenimento del minicromosoma che contiene diverse elicasi che denaturano la doppia elica
caricatori dell'elicasi
--> mediano il legame tra MCM e ORC
ORC
--> complesso di riconoscimento dell'origine che si lega all'origine di replicazione
enzimi che intervengono nella replicazione
DNA ligasi
--> forma legami covalenti per unire i frammenti di DNA adiacenti sfruttando ATP (anche frammenti di Okazaki)
DNA polimerasi
catalizza l'allungamento dei filamenti di DNA sempre a partire da
desossinucleosidi trifosfati
derivati dalle 4 basi presenti nel DNA
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
la rottura dei legami fosfoanidridici libera molta energia, usata nella polimerizzazione
lavora sempre in direzione 5'-3' quindi aggiunge nucleotidi all'
estremità 3'-OH del filamento di DNA in allungamento
ma essendo
antiparalleli
i due filamenti di DNA
filamento anticipato
sintetizzato in modo continuo in direzione 5'-3'
filamento ritardato dovrebbe crescere in direzione 3'-5' ma, sono in realtà sintetizzati in direzione 5'-3' frammenti più piccoli, detti
frammenti di Okazaki
, precursori delle molecole di DNA più lunghe neosintetizzate
ne esistono di
vari tipi
: nei batteri DNApol I, II, III (la più importante), IV, V; negli eucarioti per la replicazione nucleare alfa, delta, epsilon, per la replicazione mit. gamma
ha anche
attività esonucleasica
(di correzione di appaiamenti errati in diirezione 3'-5')
se c'è un errore, avviene lo
spostamento del filamento figlio
dal sito attiva in cui è catalizzata la polimerizzazione al sito in cui si compie l'attività esonucleasica
telomerasi
--> è una proteina che contiene anche RNA che usa come stampo per sintetizzare DNA estendendo i telomeri (sequenze di DNA ripetuto TTAGGG alle estermità dei cromosomi)
evita l'accorciamento dei cromosomi
ad ogni replicazione (quando è rimosso il primer e la DNApol arriva all'estremità non trovando un innesco)
abbondante nelle cellule germinali (ovociti e spermatozoi) e nelle cellule tumorali in continua proliferazione (evitano che il tumore si autodistrugga)
primasi
--> RNA polimerasi che sintentizza un corto primer di RNA che funge da innesco per la sintesi del DNA sia sul filamento anticipato sia prima di ogni frammento di Okazaki sul filamento ritardato
nei batteri-->
primosoma
(primasi associata a 6 proteine che svolgono la molecola di DNA e riconoscono le sequenze di DNA da cui deve iniziare la replicazione)
negli eucarioti--> la primasi non è così strettamente associata alle proteine che svolgono il DNA ma è più legata alla DNApol alfa, coinvolta nella fase iniziale
DNA elicasi
--> svolge la doppia elica di DNA davanti alla forcella di replicazione, idrolizzando ATP
topoisomerasi (di tipo I e II)
--> esegue tagli nel DNA a singolo filamento o doppio, inducendo o eliminando i superavvolgimenti del DNA, previene le torsioni che precedono la forcella
nei batteri-->
DNA girasi
, una topoisomerasi di tipo II che introduce superavvolgimenti negativi, allentando quelli positivi, idrolizzando ATP
SSBP (proteine leganti il singolo filamento)
--> si legano al DNA a singolo filamento e lo tengono svolto in modo che sia accessibile al macchinario di replicazione
REPLISOMA
--> grosso complesso con tutte le proteine coinvolte nella replicazione (il cui movimento dipende dall'idrolisi dell'ATP)
consente la sintesi dei filamenti anticipato e ritardato in modo coordinato, anche se i due filamenti hanno polarità opposte
negli eucarioti, c'è sempre una pinza a scorrimento che si lega al DNA e agisce nella stessa direzione della DNApol
(PCNA- antigene di proliferazione nucleare)
nei batteri si basa sull'assemblaggio di un complesso proteico (oloenzima) che include una
pinza a scorrimento
, caricata sul DNA dalla
proteina caricatore della pinza
, e
3 subunità catalitiche
che eseguono la polimerizzazione del DNA, collegate tra loro dalla
protena tau
G1, S, G2--> interfase
(periodo di crescita che intercorre tra 2 divisioni cellulari)
dopo il secondo ciclo di replicazione
, trovarono 2 molecole ibride di DNA e 2 totalmente di DNA-14N
per poter visualizzare il DNA con l'
autoradiografia
, il batterio da cui proviene la molecola di DNA è fatto crescere in terreno contenente 3H-timidina
nei procarioti, l'origine di replicazione è detta oriC e contiene 3 ripetizioni di 13 bp e 4 ripetizioni di 9 bp, ciascuna in regioni molto simili in altri batteri (
sequenze consenso
)
per quanto riguarda gli eucarioti, nel lievito vi sono particolari
sequenze ARS
come origini di replicazione (sequenze di replicazione autonoma) che conferiscono al DNA capacità di replicarsi autonomamente e contengono una sequenza consenso di 11 bp e altre regioni vicino ricche di AT
L'uso dell'RNA e non del DNA per iniziare la sintesi garantisce che l'inserimento di basi scorrette all'inizio sia confinato a sequenze di RNA destinate a essere rimosse alla fine (dalla Dnapol I nei batteri)
DNApol III (nei batteri) e DNApol delta e epsilon (negli eucarioti)
sono coinvolte sia nella sintesi del filamento anticipato che in quella del ritardato
le cellule senza telomerasi sono destinate a invecchiare e a morire (apoptosi), per accorciamento dei cromosomi le cellule non possono più dividersi
la pinza a scorrimento è un
fattore di processività
: permette alla polimerasi di processare il DNA senza staccarsene (nel caso del filamento anticipato); nel caso di quello ritardato, la pianza e la DNApol si staccano ad ogni frammento completato
N.B.
nei procarioti, la DNApol I rimuove i primer di RNA; negli eucarioti c'è una
endonucleasi RNasi H
che taglia i filamenti di RNA e una
esonucleasi FEN1
che digerisce successivamente l'RNA