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Cyclic-di-GMP Regulates Extracellular Polysaccharide Production, Biofilm…

- - - - 動機
        
        已知cyclic-di-GMP促進V. cholerae的生物膜形成，因此我們使用創傷弧菌的DGC(即DcpA所表現)，以及霍亂弧菌的DGC(即VCA0956所表現)來檢驗(檢查examine)高含量c-di-GMP對於創傷弧菌與霍亂弧菌生物膜形成的影響。
      - :star: 發現一
        
        方法
        
        大量表現
        
        讓霍亂弧菌N16961株攜帶載體pBAD24T(含有dcpA目標基因)
        
        讓創傷弧菌27562株攜帶載體pBAD24T(含有VCA0956目標基因)
        
        結果
        
        比較空載體/含有目標基因的載體後，生物膜的形成都有增加 (霍亂&創傷)
        
        (先證實前人文獻中的結果，同時也引出接下來的實驗動機)
      - :star: 發現二
        
        結果
        
        比較空載體/含有目標基因的載體後，生物膜的形成都有增加(創傷)，但是:warning:各菌株有不同的增加量 / 增加程度 (strain-dependent)
        
        方法
        
        將含有目標基因的載體transform進入4種菌株的勝任細胞(不含載體)
        
        clinical strain
        
        CMCP6 (南韓)
        
        1003 (美國)
        
        YJ016 (台灣)
        
        27562 (美國) = control strain
        
        資料來源ATCC
        
        quantitative CV staining / 檢測OD600的吸光值 (結晶紫CV/crystal violet) 並量化統計
        
        提高DGC的表現量，來提高c-di-GMP的產量，檢驗各菌株在高c-di-GMP含量的條件下，是否會增加生物膜的形成。
      - :star: 發現三
        
        方法
        
        將含有目標基因的載體 (pBAD24T::dcpA) transform進入2種菌株勝任細胞(不含載體)
        
        互補株 wzy::Tn10 mutant
        
        無莢膜、無致病力、透明菌落
        
        總共3種一樣的菌株: wzy::Tn10、rmlC::Tn10、Δwzc
        
        wzy是指wzy polymerase，是CPS生成所必須
        
        wt / wildtype
        
        quantitative CV staining / 檢測OD600的吸光值 (結晶紫CV/crystal violet) 並量化統計
        
        動機
        
        文獻指出CPS會抑制生物膜的形成，因此想證明CPS不是形成生物膜所必需的物質
        
        結果
        
        DcpA表現所引發增幅的生物膜形成，wt和wzy::Tn10的量化值增加地相似
    - - :star: 發現一
        
        方法
        
        滴細胞溶液到LB agar plate上(不塗盤)，並測量機動性圈 (移動範圍) / motility zones
        
        將改造過的/空的載體轉型到勝任細胞，變異株、互補株、wildtype及其他品系
        
        結果
        
        對於創傷弧菌還說，CPS抑制機動性，不是c-di-GMP抑制的
        
        動機
        
        已知c-di-GMP對霍亂弧菌來說會抑制其機動性，為證實前人的研究成果
- - - - 了解生物膜的形成作用，可以幫助降低生物膜在濾食性動物和生物體表面生成的體積量(load)，也可幫助控制創傷弧菌致病狀況(control)。
  - - - 本研究應用的情況中，CPS對於生物膜的形成沒有其必要性。
      - 致病力的關鍵
        
        可以抵抗補體系統細菌水解(bacteriolysis)及嗜菌作用(phagocytosis)
    - - 傷口感染、攝食生/未煮熟海鮮
- - - - 其中一個基因序列會轉譯出DGC
        
        使用這個DGC蛋白質，稱為DcpA
  - - - 發現：提高c-di-GMP濃度可提高EPS的產量
        
        高產出EPS無法彌補低CPS所帶來的損失 / EPS cannot compensate for the loss of CPS production
      - 發現：提高c-di-GMP濃度可以大大地強化生物膜的形成
      - 發現：提高c-di-GMP濃度可以大大地增加生物膜的粗糙度 (不依賴CPS的模式細菌)
    - - 調節多項訊息傳遞路徑
        
        纖維素合成 cellulose production
        
        生物膜形成 biofilm formation
        
        粗糙的菌落表面 rugose colony morphology
        
        致病因子 virulence factor production
        
        機動性 motility
      - 通常，越多c-di-GMP則提高細菌貼附的相關蛋白質的表達，同時抑制細菌的機動性與致病力相關蛋白質的表達
      - 降解cyclic-di-GMP
        
        調控
        
        由DGC合成；由phosphodiesterase (PDE) 降解
        
        被普遍認為是調控cyclic-di-GMP的結構域
        
        GAF
        
        PAS
        
        HAMP
        
        PBPb
        
        CBS
        
        N-terminal receiver domain of 2-component 訊息傳遞系統
        
        REC