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Réponses immunitaires initiées par les vecteurs de thérapie génique &…
Réponses immunitaires initiées par les vecteurs de thérapie génique & Mécanismes d'immunorégulation
Thérapie génique
Ac nucléique → ADN ou ARN → gène, fragments de gènes ou autres
Transporté grâce à vecteur viral ou injecté directement sous forme d'ADN nu
Gène fonctionnel qui complémente gène défectueux OU gène différent à action thérapeutique OU ARN capable de réguler ou bloquer exp° d'un gène altéré
2 principales strat : cellules modifiées in vivo directement dans l'organisme OU ex vivo c-a-d que des cS sont prélevées chez le patient puis modifiées et réinjectées
Ex d'applications : Adrenoleukodystrophie (maladie génétique avec lésions du tissu nerveux et dysfonctionnement des glandes surrénales), Parkinson, Huntington, Hypercholesterolémie, hémophilie, dystrophies, mucoviscidose, immunodéficiences, anémies
Vecteurs viraux
Il faut bien connaître les proprio des virus : tropisme, mode d'intégration, immunogénicité (...)
Réponse immune anti-virale : réponse anti-virale des LTc et prod° d'Ac
Limite RI
I.I.
TLR reco présence de PAMP
Stimule voie dép MyD88 → produit IFN et réponse inflammatoire
IFN active voie STAT → uprégu° des gènes ctrl ISRE = Interferon Stimulated Response Element
IA : prod° d'Ac contre les vecteurs et LTc détruisent les cellules "réparées"
Vecteur idéal : exp° stable ou transitoire, peut atteindre de haute c° permettant infection de nombreuses cell, techniques reproductibles simples, ex° à long terme, intégré dans site spé du chromosome ou persiste en épisome stable, possède une unité transcriptionnelle contrôlable, est dénué de composants induisant RI → MAIS un vecteur moins parfais sera souvent adéquat
Vecteurs viraux : adénovirus, virus adéno-associé (AAV), rétrovirus (oncorétrovirus et lentivirus), virus herpes, virus à ARN (polio, sendaï...)
Vecteurs non viraux : ADN nu ou liposomes
Adénovirus
:check: Grande capacité (30-40 kb), facile à produire à hauts titresn infecte les cell non mitotiques
:red_cross: Ne s'intègre pas et est immunogénique pouvant être fatal (moins si éviscéré)
Retrovirus
:check: Capacité raisonnable (10 kb), facilité de prod° adéquate, infecte cellules non mitotique (lentivirus), s'intègre, pas de transfert de séq codantes virales
:red_cross: s'intègre au hasard, n'infecte pas les cell non mitotiques (oncoretrovirus)
AAV
:check: Infecte les cell non mitotiques
:red_cross: Faible capacité (4 kb)
AAV WT
Virus AAV sauvage
Découvert comme contaminant de préparation d'adénovirus
Parvovirus humain non pathogène répandu chez H et animaux
Dependovirus : infection productive requière en + des fct cellulaires, la présence d'un virus auxiliaire (adéno, HSV, HPV...)
Virus non enveloppé contenant génome linéaire d'ADNsb
50 sérotypes humains et non humains, le 1er découvert est le AAV-2 et les sérotypes 2 à 9 sont utilisés en transfert de gène
Génome viral
3 promoteurs et une polyA
4 prot de réplication :
Rep 78, 68, 52, 40
Extrémités :
ITR = Inverted Terminal repeats
forme boucle
3 prot structurale
Cap
:
VP1 2 ou 3
Cycle viral
AAV → Latence ou Réplication & Latence → Réplication
Latence : persistance du génome sous forme épisomale ou intégrée (Chrms 19 locus AAVS1), pas d'exp° de gènes viraux
Réplication : synth prot Rep et Cap et assemblage d'AAv dans le noyau
Traffic intracellulaire
A) Attachement au R et coR : HSPG, R au FGF-1 et intégrines αvβ5
B) Endocytose dans vésicules recouvertes de clathrines
C) Passage par les endosomes précoces (pH neutre) puis tardifs ou lysosomes (pH acide) & modif des capsides par pH et Nter de VP1 exposé
D) Accumulation des capsides dans région péri-nucléaire
E) Translocation dans noyau
Etapes intra-nucléaires
Db → 3) trans°/trad → 4) Rep → réplication ADN viral puis encapsidation ou directement encapsidation
1) Décapsidation → 2) conversion sb en db
Db → Assemblage (VP) → encapsidation
Réplication : sb →
ADN pol
→ db → coupure ITR par
Rep
(endonucléase) →
Helicase, Polymerase
→ Re-initiation (ITR) →
ADN pol
+ déplacement brin
Vecteurs AAVr
ITR sont les seuls éléments viraux conservés dans vecteurs
Prod° : transfection → purif à partir de lysats cellulaires sur les gradients de densité → titration
Tissus cibles : muscle, foie, cerveau et rétine
:check: : non patho et particules virales induisent faible RI.I., très résistant, abs de séq virales codantes, exp° stable du transgène
:red_cross: : taille transg limité (4.7 kb), techniques de prod longues, peu efficaces et difficiles à transporter à grande échelle, transduction inefficace de certains tissus, tropisme AAV-2 très large donc pb ciblage
Solutions pour surmonter limites
Taille : AAVr chevauchant + Trans-épissage → vecteur unique
Niveau de transduction
Création AAVdb
= self complementary AAV = scAAV
car étape conversion en db limite transduction des tissus → génome AAVr ayant 50% de la taille du WT pouvant être encapsidés sous forme de dimère ou de monomère diploïdes
Obtention de vecteurs AAVr de différents sérotypes → meilleur transduction car utilisation R diff, meilleur trafficking intracell des particules et meilleure décapsidation des génomes dans noyau
Restreindre tropisme : Modifier génétiquement capside → insertion peptide connu (ex peptide de liaison à intégrine ou aux IgG) → amplif → particules AAVr avec capsides mutées
Pb qui restent
Possibilité de mutagenese insertionnelle liée à l'intégration possible des vecteurs in vivo & RI in vivo
AAV considéré comme peu immunogène mais RI observées contre produit du transg (érythrocytes) et capside virale (Ac, inflam°, réponse T (IFNg))
Prod° à large échelle, evaluation tox de gros modèles animauxn form° tumeursn dissémination et induction RI restent à éclaircir
