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HPLC - Coggle Diagram

- - - - Connexion trop longue -> risque de fuites
      - Connexion trop courte -> volume mort, zone de mélange perte de résolution
  - - - 2 types
        
        Pompe haute pression
        
        Double voies et chambre de mélange en sortie de pompes
        
        Pompe basse pression
        
        Électrovannes en amont des pompes
    - - Débit
        
        0,01 - 10 mL/min
        en général = 1mL/min et constant
      - Pression limites
        
        Minimal = qqs bars
        Maximale = pression limite d'utilisation sans endommager la colonne (HPLC < UPLC)
      - % des éluants
        
        constants -> mode isocratique
        
        Variables -> mode gradient
  - - - Facteurs physiques, N, efficacité, vitesse
    - - Facteurs chimiques
        alpha, k, Rs
    - - Chemin de diffusion courts
        
        Transfert de masse rapide
        
        Débit élevé sans élargissement des pics pour la Fast LC
      - Distribution étroite de la taille des particules
      - Stabilité de la colonne
      - Haute transmission de chaleur
        
        Echauffement par friction minime
        
        Efficacité des colonnes
      - Meilleure résolution à de plus faibles pressions avec des temps de rétention plus courts
  - - - Détecteur universel : tout soluté dont l'indice de réfraction est différent de celui de la phase mobile peut être détecté
      - Détecteur différentiel
        Moyennement sensible (10-2 M)
      - Mode isocratique essentiellement
      - Sensible à la température
    - - Basés sur les propriétés spécifiques des composés soumis à une excitation lumineuse
      - 2 types
        
        Monochromatique
        
        Nécessité que l'éluant n'absorbe pas
        
        Sélectif mais limité aux composés absorbants (200-800 nm)
        
        Nécessité de connaître le spectre d'absorbtion des solutés
        
        A concentration égale, deux solutés différents donnent deux signaux d'intensités différentes -> importance de déterminer les facteurs de réponse
        F = S (lamda) / C
        
        Cas particulier
        
        Détection UV directe
        
        suivre les variations de concentration des espèces -> existence de différences de propriétés entre E- et S-
        
        Détection indirecte
        
        suivre la variation de la concentration en E- au cours de l'élution de S -> utilisation d'une propriété spécifique de E-
        
        Barretes de diodes
        
        Permet à chaque instant d'enregistrer un spectre complet entre deux limites
        
        Permet l'obtention d'un chromatogramme en 3D
        
        Extractions du 3D
        
        Coupe à longueur d'onde fixée : chromatogramme à 2D classique mono longueur d'onde
        
        Coupe à t fixé : spectre UV qui fournit des renseignements structuraux sur le composé élué à cet instant
    - - Basé sur la propriété des composés à émettre sous l'éffet d'une exication UV ou sur l'utilisation d'un réactif afin de rendre fluorescent le composé à analyser
      - Avantages
        
        Plus sensible que le détecteur d'absorption
        Très spécifique
        Peu sensible aux variations de débit et de température
        Peut être utiliser en mode gradient
      - Inconvénients
        
        Très spécifique
        Sensible à l'oxygène dissous
        Utilisation de solvants très purs
    - - Conductivité (x) : capacité à conduire le courant électrique
      - Mesure de la conductance (G) de PM entre deux microélectodes dans une cellule de fable volume
      - Avantage : utilisé pour des soultés ioniques
      - Inconvénient : sensible à la température
    - - Permet de détecter, d'identifier et de quantifier des molécules par la mesure de leur masse
      - Parties
        
        Sources d'ionisation douces
        
        ESI (electrospray)
        
        Permet la production des ions d'un composé en solution
        
        Adaptée aux composés polaires et ioniques
        
        Obtention d'ions pseudomoléculaires généralement protonés [M+H]+ ou déprotonés [M-H]- parfois multichargés
        
        Obtention d'spèces cationisés ([M+Na]+, [M+K]+...)
        
        APCI (atmospheric pressure chemical ionisation)
        
        APPI (atmospheric pressure photonic ionisation)
      - Analyseur
        
        Permet de séparer les ions en fonction du rapport masse/charge 9m/z) et de mesurer ce rapport
        
        un cham magnétique, un champ électrique ou des combinaisons
      - Détecteur
        
        Permet de compter les ions (signal proportionnel au nombre d'ions de chaque masse)
        
        Une seule masse est détectée à un temps t
  - - - Suppresseur à lit fixe (Metrohm) : module à 3 colonnes en rotation pour analyse des anions (colonne fortement cationique) -> éluant carbonate et hydrogénocarbonate
      - 3 étapes:
        1) régénération
        2) analyse
        3) rinçage
      - Neutralisation éluant:
        R-SO3-H+ + Na+ + HCO3- -> R-SO3-Na+ + H2CO3
      - Augmentation sensibilité anion:
        R-SO3-H+ + Na+ + HCO3- -> R-SO3-Na+ + H2CO3
    - - Suppresseur à fibre ou à micro-membrane
        
        Faible volume mort + force capacité ionique -> éluation avec gradient de concentration (faible dérive de la ligne de base)
      - Membrane à fibre creuse (AMMS)
        
        Association de 2 membranes + double contre-courant de régénérant -> meilleure efficacité
        
        Récent dispositif : l'auto suppresseur (H+ sont apportés par la recirculation des acides détectés)
      - Suppresseur à régénération électrochimique
        
        Colonne avec une résine régénérée par électrolyse
        
        Suppresseur à membrane avec ions régénérant produits in situ par électrolyse de l'eau
        
        Pour un mélange d'anions sur une colonne anionique -> éluant cotenant de la soude diluée + une membrane perméable aux cations
- - - - Phase normale -> séparation des composés polaires
        PS polaire
        PM apolaire
      - Phase inverse -> séparation des composés apolaires
        PS apolaire (silices greffées alkyl, copolymère styrène-divinylbenzène)
        PM polaire ( eau-MEOH, eau-ACN)
    - - Support inerte : gel de silice
        PS (motif organique) fixée chimiquement (liaisons covalentes)
      - Principales phases : polarité
        C18-C8 < phényl (-C6H5) < Nitrile (CN) < Silice (SiO2) < amine (NH2) < Diol
    - - Phases stationaire
        
        PS à base de silice non utilisable à pH > 7,5 ( attaque du réseau silicieaux par OH-)
        
        PS styrène-divinylbenzène plus stable chimiquement (pH 0-14)
      - Phase mobile (éluant)
        
        Pouvoir éluant
        
        Attention à la miscibilité des solvants
      - Mécanisme de rétention
        
        Mécanisme 1
        1) Le solvant organique de PM se fixe préférentiellement à la surface des greffons apolaires
        2) Le partage des composés entre PM et la phase liquide adsorbée
        
        Mécanisme 2*: effect d'hydrophobicité** : association réversible du composé avec les greffons
        
        Soluté est très apolaire : mécanisme 2
        Soluté est polaire : mécanisme 1 et 2
      - Rôle du soluté : rétention est liée à l'interaction hydrophobe
        
        Evaluation du pouvoir hydrophobe
        P = C octanol/ C eau
        
        P ++ -> composé est ++ hydrohpobe -> ++ afinité avec PS
    - - Phase stationnaire : silices greffées motifs organiques (R = NH2 ou OH)
      - Phase mobile : Alcane (hexane, heptane, cyclohexane..) + solvant polaire en faible eteneur (chloroforme, dichlorométhane, méthanol, acétonitrile, tétrahydrofurane (THF)...)
      - Mécanisme : solvatation des greffons polaires par le solvant polaire contenu dans PM
        
        Composés vont :
        1) Interagir avec la phase liquide polaire stationnaire
        2) Déplacer des molécules de cette phase ( de façon plus intense que leur polarité est élevée
  - - - Echange simple
        
        PS ammonimum (N+), Anion (A-) et un contre anion E- de PM
        A- PM + E- PS <=> A- PS + E- PM
        
        Rétention du composé contrôlée par
        
        Différence d'affinité entre A- et E- et la PS
        
        Concentration de E- dans la PM
        
        Différences d'affinité dépent des caractéristiques physiques des ions solvatés
        
        ++ d'afinité avec
        
        ions porteurs de la charge la plus grande
        
        ions de plus petites dimensions
        
        ions de plus forte polarisabilité
      - Echangeur d'anions :
        Citrate > SO42- > oxalate > I- > NO3- > SCN- > Cl- > formiate > acétate > OH- > F-
      - Echangeur de cations:
        Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+
    - - Résine cationique : chargée négativement
        
        Fortes : sulfonique
        
        Intermédiares : groupement phospho
        
        Faibles (non ionisées en milieu fortement acide) : carboxylique et carboxyméthyl
        
        Très faible (uniquement ionisées en milieu alcalin
      - Capacité d'échangeur ionique (Q):
        
        quantité maximale d'ions que peut fixer l'échangeur d'ions
        
        faible (Q<100), mayonne (100<Q<200), forte (Q>200)
      - Résines anioniques : chargée positivement
        
        Fortes : groupements aminés quaternaires et tertiaires
        
        Faibles : groupements aminés secondaires et primaires
      - Structure des phases stationnaires
        
        Macroporeuses : copolymère PS et divinylbène + groupes fonctionnels greffés
        
        Avantages
        
        Grande capacité d'échange -> détection correct
        
        Très bonne efficacité (taille des particules fibles et distribution granulométrique étroite)
        
        Excellente résistance aux solutions aqueuse
        
        Inconvénients
        
        Longs temps d'analyse pour les composés fortement retenus
        
        Médiocre résistance mécanique -> utilisation à faible P et coût de fabrication élevé
        
        Pelliculaires
        
        Polymère (latex) déposé à l'état sphères jointives pour former une pellicule de 1 à 2 um d'épaisseur sur un support imperméable
        
        Avantages
        
        Réalisation de séparation fines en de très courts temps
        
        Excellente résistance mécanique (sites greffés sur un support compact imperméable)
        
        Inconvénients
        
        Faible capacité d'échange (sites actifs qu'en surface) -> injection de faibles volumes et technique de détection très sensible
        
        Support inerte + film polymère
        
        Avantages
        
        Résistance à la pression (analyses rapides)
        
        Grande efficacité (granulométrie faible et compacte)
        
        Grande capacité d'échange (grande surface de contact)
        
        Inconvénient
        
        Mauvaise résistance aux solutions aqueuses
        
        Domaine de pH est limité à 2-7
    - - Solution aqueuses chargées d'ions salins ou organiques
      - Addition de 20% max solvant organique (EtOH, MeOH ou acétone) -> augmentation de la solubilité de certains composés et leur sélectivité
      - Addition des ligands -> meilleure séparation
      - Rétention des espèces dépend de
        
        Concentration totale des ions de la solution (déplacement de l'équilibre d'échange)
        
        pH (ionisation des espèces à séparer et/ou des groupements fonctionnels)
      - Facteur déterminant le choix de PM
        
        Techniques de travail et de détection
        
        Mono-colonne : sans suppression chimique
        
        Avec suppresseur
        
        élimination des ions de l'éluant + augmentation de la sensibilité
        
        détecteur = conductimètre
        
        analyse des anions
        
        Nature chimique et concentration de l'éluant
        
        Valeur du pH
        
        Détermine le degré d'ionisation des acides et bass faibles et la concentration des ions en solution
        
        En milieu plus acide (pH < pKa) -> augmentation ionisation -> plus de BH+ en solution -> rétention plus importante des espèces
        
        légèrement > pour les bases
        légèrement < pour les acides
        pKa +- 1 à 1,5
        
        Force ionique (I)
        
        I ++ -> concentration ++ -> force éluant ++ -> rétention --
        
        Nature du contre ion de la PM
        
        Modifie la rétention des espèces : plus PS a l'affinité pour le contre ion -> la rétention plus faible
        
        Influence de la température
        
        T ++ -> cinétique des échanges ++ -> efficacité ++ -> meilleure résolution mais sélectivité légèrement diminuée
        
        Mode d'élution
        
        Présence d'un suppresseur
  - - - Molécules grosses exclues des pores de la PS migrent plus rapidement que les petites molécules
    - - VR = VM + fVp
        f : fractioni du volume poreux de PS accessibles aux molécules X (0<f<1)
        VM : volume interstitiel de la colonne
        Vp : volume des pores de PS
      - f = 0 -> les molécules sont exclues de PS et VR =VM
        f = 1 -> tous les pores de la phase fixe sont accessibles aux molécules : VR =VM + VP =Vt ; Vt = volume total de perméation total
    - - Gel (solide poreux + liquide qu'il contient)
        
        Gels hydrophiles (gel de dextane ou de plyacrylamide) -> séparation de moléclues solubles (polysaccharides, protéines...) dans les éluants polaires (eau et tampons)
        
        Gels hydrophobes (gel de polystryrène-divinylbenzène) -> séparation de molécules peu polaire ou apolaires (lipides, polymères synthètiques...) solubles dans les éluants apolaires (THF)
  - - - Perte de charge ++
        Pression ++
        
        Diminution de la longueur de la colonne
        
        Travail à plus haute température -> moins de viscosité et diffusion plus rapide -> moins perte de charge
        
        Système supportant de plus haute pression
  - - - Modification polaires sur la silice ou les polymères (SiOH, NH2, diol...) comme en phase normale -> sulface globalement neutre mais hautement polaire
    - - Mélanges de tampons aqueux et de modifiants organiques comme CH3CN ou MeOH comme en phase inverse
    - - 1) Formation d'une couche riche en eau à la surface de PS polaire -> une distribution entre ces deux couches
      - 2) Mécanisme électrostatiques faibles et des donneurs d'hydrogène entre les molécules neutres polaires sous des conditions d'élution fortement organiques
      - 3) Composés les plus polaires auront une plus forte interaction avec la couche d'eau stationnaire