Variations du nombre de copies des gènes
Intro
SNV = Single Nucleotide Variation : substitution, délétion, duplication ou insertion
CNV : Copy Number Variation
copies d'un fragment de chrms, gène ou fragments d'ADN
perte ou gain
variants structuraux
aneuploïdie = gain ou perte chrms
aneuploïdie segmentaire = gain ou perte d'un segment de chrms
délétion ou insertion fragment ADN
duplication
amplif
autres : insertion d'un élément mobile, inversion, translocation équilibrée
petite taille : 1-10 kB
fréquent dans génome humain
→ accidents génétiques : adaptation à l'env → résistances aux infections, modif comportement alimentaire
Détection des différents types d'altérations
Méthodes d'analyse ciblée : recherche SNV par séquençage Sanger ou de CNV par QMPSF ou MLPA
Méthodes pan-génomique = à l'échelle du génome : rechercher SNV par NGS et recherche CNV par NGS et CGH-array
CGH-array
Sur lame de verre, pose de sondes → hybridation compétitive entre ADN ctrl et ADN à analyser
Résolution de l'ordre du kb
→ microarray = puce ADN
marquage par fluo
Protocole CGH-array
1) Contrôle qualité des ADN : Dosage précis de c° par spectrophotométrie et évaluation pureté par calcul ration → absorbance 260/280nm > 1.8 (ac nucléiques/prot) & absorbance 260/230nm > 2 (ac nucléiques/contaminants)
2) Marquage des ADN : utilisation nt dUTP couplé avec cyanine fluo pendant étape d'élongation des amorces
3) Pooling des ADN : pour un patient, tube de son ADN marqué en rouge + tube ADN ctrl d'au moins 10 individus du même sexe, marqué en vert → pool des 2 tubes de façon équimolaire
4) Hybridation : dépôt mélange ADN sur lame de verre puis hybridation à 65°C pendant 24h dans un four à hybridation sous rotation
5) Lavage : élimination des contaminants et fixation non spé
6) Scanner : lecture fluo de rouge et vert
7) Analyse bioinformatique : calcul ratio fluo pour chq spot et représentation graphique des spots le lond du chrms → Log 2 du ratio négatif = perte de copie d'ADN et positif = gain de copie
8) Contrôle qualité : indicateurs à surveiller → intensité du signal, bruit de fond, ratio signal/bruit, ratio fluo, ctrl nég, saturated features
9) Visualisation des résultats : logiciel Agilent → DNA Analytics → vue génomique, vue chromosomique, vue génique
Puces CHG-array
Flexibilité de la taille
Lames à façon : technologie AGILENT → lame de verre à haute densité d'oligo de 60b
Il existe puces CHG dédiées à TP53 avec gène TP53 + Régions 5' et 3' du gène + 150 000 sondes pangénomqiues + 24 gènes de la voie p53
Avantages et limites CGH-array
Avantages : exploration de l'ensemble du génome, résolution 1000x pus imp du caryotype, haute résolution (détection des CNV de petite taille), loca précise des CNV (facilitation interprétation)
Limites : ne détecte pas réarrangement équilibrés, bcp d'artefacts dans régions riches en GC
DNAseq
Profondeur de lecture
Alignement des reads
Normalisation et correction des biais (artefacts)
Détection des CNV → réf pour comparaison à un autre échantillon ctrl ou groupe
Paired-end mapping : clustered read pairs
→ taille insert et détection taille aberrante
Méthode split reads
→ détection délétion, duplication et insertion
Méthode assembly-bases
Combinatorial approach : paired-end mapping + profondeur
→ sensi et spécificité imparfaites donc ncssite méthode ciblée pour valider existence variant structural
Méthode ciblée
QMPSF
1) Amplif simultanée de petits fragments fluo (nbr cycle PCR limité) 2) Séparation de tailles par électrophorèse sur séquenceur automatique 3) Superposition informatique du profil du patient pour un ctrl utilisant amplicon ctl extérieur 4) Comparaison de la hauteur des pics
Détection de délétion et duplication hétérozygotes
= Quantitative Multiplex Pcr of Short Fluorescent fragments
MLPA
= Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Liaison par ligase de 2 fragments ssADN de façon covalente si hybridés
Amplif produit de chq sonde a longueur unique
Limites : inversions non détectées, ré arrangements équilibrés non détectés, perte du côté quantitatif pour les amplif