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Stratégies d'analyses exomiques - Coggle Diagram
Stratégies d'analyses exomiques
Introduction
Exome = ensemble des exons codant et non codant du génome. Taille à 60 Mb et représente 2% du génome
2007 : découverte de la diversité génomique entre individu mais aussi qu'il exite une entité plus infime que le génome codant des protéines → exome
Séquençage exome
Stratégie d'analyse : + il y a d'échantillons moins l'analyse est chère et le séquençage sensible à une région du génome
A partir d'un ADN génomique → fragmentation (ADN à 200pb) → Ligase et adaptateurs → enrichissement par capture avec l'Agilent SureSelect → sondes spé biotinylées incorporées dans échantillon → hybridation → capture sonde avec bille magnétique marquée à la streptavidine → lavage → PCR 14 cycles → séquençage par ion torrent ou Illumina → librairie
Séquençage génome
Avantage : couverture proche de 100%, accès régions non codantes, détection variation de copies des gènes + efficace, détection inversions/translocations équilibrées
Inconvénients : coût, profondeur de lecture souvent moindre, stockage informatique, capacité de calcul ncssaire, difficulté d'interprétation
Séquençage régions ciblées = panel de gènes
Avantages : cout moins élevés, profondeur de lecture + importante possible, moins gourmand en capacité de séquençage, stockage, capacité de calcul, détection de ce qu'on cherche et pas de découverte accidentelle
Inconvénients : ncssité d'une étape d'enrichissement (coût non négligeable et + long), couverture incomplète, détection CNV moins fiable et efficace, non détection des inversions/translocations
Enseignement du séquençage massif dans pop
20 000 variants dans exome codant et lorsque rare et détecté chez un seul individu =
singleton
Si variant > 1% on parle de polymorphisme. Chez un adulte, 54% des 1% n'ont été détecté qu'une seule fois
Certains variants fréquents d'autres non dans sous pop ainsi variant peut être propre à un groupe → notion de
stratification génétique
Fréquence très élevée de mutation de nova qui apparait au niveau des gamètes ou oeuf fécondé → en moyenne 70-80 mutations par génome et 0-2 par exome
Analyses
Beaucoup de gènes ressortent dans analyse exome → faux positif ou gènes polymorphiques ou gènes très longs → souvent gènes asso à des R ou HLA → exclus lors de la filtration sur la fréquence allélique
Analyse se base sur fréq allélique + process de filtration qui met en jeu les bases de données afin de filtrer les variants
Filtration sur la fréq allélique (
MAF
) doit tenir compte de la fréq de la maladie mais aussi mode de transmission de la maladie
Variant perte de fonction : en moyenne, exome comprend 100-150 variants perdant leur fonction (rare) et n'amène pas forcément à une patho
Variant faux sens : triés en fonction de la prédiction in silico sur l'impact qu'ils auront sur la prot ou sur l'épissage alternatifs des ARNm
Prédiction in silico sur impact protéique
Scores de prédiction de pathogénicité fonctionnels → ~150 variants restant → ncssité d'une strat de comparaison
Scores de conservation
Scores "ensemble"
Calcul prédiction de nbrx scores sur tous les variants faux sens possibles de l'exome
Utilisé comme base de données par ANNOVAR pour annotation
Stratégie d'analyses de l'exome : ex du cancer
Cancer génétique issu de mutation ou transmission héréditaire → séquençage NGS permet de séquencer gènes impliqués dans dév patho et on observe chez les patients qui ont prédispositions génétiques au cancer s'ils possèdent variations → par séquençage d'exon on peut observer s'il y a de nouveaux gènes codants impliqués dans dév de la patho
Analyse exomique comparative intrafamiliale
→ séquençage 2 individus de la même famille mais éloignés qui ont chondrosarcome → 200 variants communs dont 1 perte de fonction → séquençage Sanger a démontré que tous les malades possèdent cette variation perte de fonction
Observation alors similitudes sur plusieurs patients pour identifier gène muté →
stratégie d'exomes comparatifs
Analyse exomique soustractive "analyse de trios"
: il y a des mutations de novo qui apparaissent pré- ou post-zygote, cette analyse consiste à retirer tous les variants de novo pouvant être à l'origine de la patho → permet d'étudier nouvelles voies moléculaires à l'origine de certaines patho