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Single cell - Coggle Diagram
Single cell
10X Genomics
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Chq cellule capturée par une bille dans une nanogoutte, identifiant cellule unique + UMI
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Smart-seq
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1) Capture ARNm via queue polyA → utilisation RT M-MLV ajoutant C + oligo de switch = TSO ajoutant G → amplif → fragmentation avec transposase : introduit séq spé identique → intro d'adaptateur en 5' et 3'
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2) Oligont pour marquer cellule → chq transcrit aura code barre (= index cellulaire) pour reconnaître à la fin 3) PCR 4) Séquençage full length 5) Illumina.
Transcriptomique RNAseq
Bulk vs cellule unique ] tissu, tumeur, organoïde
• Single cell = sortir transcriptome de chaque cellules → mee hétérogénéité
• Bulk : exp° génique moyenne
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Technique single cell : capturer info du profil génique d'une cellule unique → 96 puits OU microfluidique OU nanogoutte (Drop-Seq), OU utilisation de grilles OU eppendorf (...)
Drop-Seq
Nanogoutte hydrophile au sein d'une solution hydrophobe → contient 1 cellule + particule qui capte les transcrits
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1) Lyse pour libérer ARN → hybridation avec oligont = capture → casse émulsion 2) RT avec TSO 3) Intro code barre et UMI (quantification pour 1 transcrit) 4) Amplif 5) Séquençage Illumina en 3’ des ADNc → fragments courts → Librairie
Applications
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Analyse infiltrat tumoral, mee méca inhibiteurs, identif° marqueurs prédictifs (progression)
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Alignement et comptage
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Pour chq séq : quantification par barre code et UMI → comptage des reads = fragments séquencés + comptage des UMI par cellules
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Contrôle qualité
Filtrage de séq ARN ribosomal, mitochondrial (mort cellulaire)
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Couverture transcriptome
Bulk RNAseq (Truseq RNA)
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Couverture : 80-95% du transcriptome selon profondeur séquençage (= nbr de fois qu'une base est lue)
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Analyse exploratoire
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Représentation graphique
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N cellules (10-50 dimensions) → tSNE, UMPA... = méthodes de réduction non linéaires → espace à 2 dimensions selon cluster
Analyse en composante principale : identif° groupe de variables → donne vecteur qui diminue variabilité des données → étude exp° différentielle des gènes → visualisation par heat map
Single cell multiome ATAC-seq + RNAseq : ATAC = Assay for Transposase-Accessible Chromatin : accessibilité de la chromatine