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Fagos
Son parásitos intracelulares obligados que se replican al interior de las bacterias. Presentan dos tipos de ciclos replicativos:
Lisogénico
A pesar de que insertan su material genético en el de la bacteria, entran en un estado quiescente y no se replican, en este momento se le llama profago. Condiciones adversas pueden generar que el profago comience a replicarse y entre en un ciclo lisogénico.
Lítico
Después del periodo de eclipse, se genera una acumulación intracelular de viriones tal que rompen a la célula, liberándose.
Descubiertos desde 1896 por Hankin pero no fue hasta 1917 cuando Felix d´Herelle los llamo bacteriófagos.
Fagoterapia
D´Herelle fue el primero en usar fagos para combatir tifus en pollos y disentería en humanos. Actualmente se ha retomado este campo de investigación por la creciente tasa de de bacterias resistentes a los antibióticos.
La infección por fagos se da gracias a la unión de receptores específicos de la célula que reconocen al ligando del fago.
Titulación de fagos
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Del caldo anterior, centrifugar a 3500 rpm/3 a 5 min y recuperar el sobrenadante. Hacer un tratamiento con fenol para eliminar por completo las bacterias.
Hacer diluciones decimales comenzando con tubos con 4.5 mL de SSF y agregando 0.1 mL del sobrenadante con fagos e ir transfiriendo al tubo siguiente 0.1 mL. Hacer al menos diez diluciones.
En agar blando mezclar 0.1 mL de suspensión bacteriana y 0.1 mL de las diluciones hechas. Cada dilución se sembrará por doble capa en una caja diferente. Preparar una caja con control de bacterias y otro de fagos.
Incubar a 37°C 24 h. Contar las placas líticas y multiplicarlo por el inverso de la dilución. Dividir entre 0.1 mL para obtener el número de unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL).
Obtención de fagos
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Tener un cultivo de 24 horas previamente de E. coli W3350 y con el preparar una suspensión igual al tubo 0.5 del Nefelómetro con SSF y reservar.
A un tubo de agar blando se le agrega 0.1 mL de el sobrenadante de fagos y 0.1 mL de la suspensión bacteriana. Agitar y vaciar rápidamente a una caja de agar Luria u otro medio mínimo. Distribuir por toda la superficie.
Hacer un control de bacterias y otro de solo fagos para verificar que en la solución de fagos no hay contaminación con otras bacterias. Colocar en incubación a 37°C por 24 h.
Propagación de fagos
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Colocar 20-25 mL de caldo y de suspensión bacteriana de E. coli W3350 y ponerlos en un shaker hasta que el caldo se vea turbio .
Colocar el cubito con la placa lítica en el matraz. Incubar a 37°C por 24 h. Al finalizar el tiempo debe verse el medio claro.
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