Analyse transcriptomique
Principales techniques d'analyses transcriptomiques
Transcriptome = ensemble des ARN
Diff cellule saine et cancéreuse = même génome mais transcriptome, protéome et métabolome différents
RT-PCR
Oligo dR : RT pour ARNm
Random hexamer : RT de tous les ARN
Amorces : RT transcrit d'intérêt
→ PCR : En point final (classique), quantitative (temps réel), multiplex (K amplicons) ou Long-Range (amplification transcrit entier car polymerase + efficace)
→ Séquençage Sanger ou NGS
Puces à ADN (micro array)
Profil d'exp° du transcrit du gène
ARNm → RT → ADNc → fluo + hybridation avec sondes ADN → Analyse exp° globale selon fluo
Puces à ARN
Analyse différentielle d'exp° à large échelle : identif° de 25 000 à 50 000 transcrits
Signature transcriptomique
Extension puces ADN
miARN : moins instable que transcrit classique, complexe entre miARN et ARNm bloquant transcrit
Limites : hybridation pas à 100%, capture de transcrit seulement connus et pas de dif° des transcrits alternatifs (normaux ou non)
Séquençage à haut débit : RNAseq
Application du NGS : même technique mais librairies différentes
1) Purification : Purif polyA : ARNm OU Exclusion ARN ribosomaux seulement
2) Fragmentation : chimique ou enzymatique OU RT puis fragmentattion ADNc (sonique, enzymatique...)
3) Préparation librairies : RT et fix° adaptateur brin spé
4) NGS
Illumina
Haut débit : 1% du génome transcrit mais +srs copies donc couverture doit être importante et ncssite bcp de reads par échantillons (>200 millions pour transcrits rares et > 50 millions pour 1 transcriptome)
Ciblée
PCR : peu coûteuse mais 1-10 transcrits max
Capture des transcrits : milliers de transcrits mais sondes coûteuses (billes magnétiques avec streptavidine/biotine)
Autres applications : ARNlnc : traduits dans cancers ; ARN circulaires : non codant mais participe à exp° de d'autres
Single cell RNAseq : identification de sous pop, isole différentes étapes d'un process bio (...)
Long read en RNAseq (séq transcrit entier)
Nanoporetechnologie
ARN passe dans le pore ce qui modifie flux d'e- détecté par machine qui analyse quelle base est passée dans le pore
Transcrit entier et pas cher MAIS quantification peu précise, bcp d'erreur de séq et 1-2 échantillons par flow cell
Sequel technologie = PacBio : moins d'erreur car même ADNc lu plusieurs fois mais uniquement qualitatif, 1-2 échantillons par flow cell
Analyses bioinformatiques
Etapes
1) Alignement : paramètrage de librairie brin spé sens ou anti sens ; longueurs des reads; nbr d'erreurs acceptées
2) Annotation : à quoi ça correspond par rapport aux données, avec différents programmes
3) Quantification : compter nombre de reads par gène, exon, jonctions
Normalisation nombre de read
Valeur en RPKM = reads per kb of exon model per million reads
Valeur en FPKM = fragments per kb of exon model per million reads (~RPKM quand sb)
Visualisation des données par logiciels
Applications signature transcriptomique en RC
Techniques et moyen d'application : RNAseq ou microarray : analyse différence d'exp° des 23 000 gènes → quelques gènes identifiés → mise au point RT-qPCR → Test biomarqueur
Core biomarqueur : intégration dans un modèle stat
Choisir un seuil : courbe ROC
Mesure de performance
Ex : OncotypeDx (Genome Health) : test diagnostic moléculaire permettant d'analyser bio individuelle d'une tumeur du sein par évaluation de l'act de 21 gènes à partir du tissu tumoral