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SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE MALATO, FASE 2, FASE 3 -…
SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE MALATO
E' possibile determinare l'ordine con cui gli amminoacidi sono uniti nella catena polipeptidica.
Tale analisi avviene in più fasi
FASE 1
Idrolisi parziale o specifiche di legami peptidici, catalizzata da enzimi proteolitici, generando frammenti specifici
es. come tripsina
Si opera in condizioni drastiche riscaldando intorno i 100°C in presenza di HCl 6M
La degradazione di Edman che consiste nell'utilizzo del fenilisotiocianato per rimuovere e identificare l'amminoacido n-terminale di peptidi e proteine
utilizzata per quei frammenti i quali non superano le 50 unità
Il sequenziamento dei frammenti che si sovrappongono permette di ricostruire l'intera sequenza della proteina
Perché si fa?
La determinazione della struttura primaria delle proteine è fondamentale per comprendere al meglio i meccanismi di azione
Inoltre ha permesso di risalire alle cause di numerose malattie
taglio del peptide tramite uso di
es: tripsina o chimotripsina
agenti chimici
es: BrCN
utilizzato per...
...determinare la struttura di un peptide
individuazione del C-terminale
si utilizza l'enzima carbossipeptidasi
idrolizza il legame peptidico dell'amminoacido C-terminale
successivamente vengono spezzati i seguenti legami peptidici
frammentazione del peptide e confronto dei frammenti
idrolisi
chimica
enzimatica
si ottengono frammenti brevi ma identificabili
i frammenti vengono identificati in quanto bisogna determinare la sequenza originale
si utilizza la sovrapposizione di sequenze
individuazione del -N terminale (metodo Singer)
si fa reagire il peptide con il DNFB (2,4dinitrofluorobenzene) formano il DNP-peptide
si idrolizza spezzando tutti i legami peptidici rimanendo, in questo modo, solo -N terminale (il quale viene legato dal DNFB, formando un complesso giallo
identificato con il metodo della cromatografia
FASE 2
FASE 3