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argomentoS4, LA DETERMINAZIOBE DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI, metodi e…
argomentoS4, LA DETERMINAZIOBE DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI, metodi e tecniche di laboratorio
vi sono varie
metodologie di analisi
di laboratorio,
di microbiologia classica,
ma anche
con metodologie
di tipo molecolare,
con applicazione
anche nel campo
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-
-
-
-
-
perchè se io,
che i microrganismi
crescono
in un alimento,
il compito di
questa materia,
è mettere a punto,
delle metodiche
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-
-
TERRENI DI COLTURA
-
e possono essere,
vi possono essere
-
e poi di sintesi,
che possono essere
o terreni ricchi
dove vengono addizionati,
-
o terreni minimi,
con una composizione,
calcolata per
ogni singolo costituente,
e che poi vanno
a rappresentare
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e i terreni
possono essere,
o liquidi,
-
poi è orbito
per la crescita microbica,
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o solido,
per aggiunta di agar al 1,5%,
ed è un terreno,
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-
e uno dei primi studiosi,
-
lo sviluppo in laboratorio,
si fa perchè,
se io ho microrganismi
in un alimento,
-
e mi possono dare
dei problemi,
come i contaminanti
che possono
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e ciò perchè,
in un sistema
di laboratorio,
in coltura pura,
io posso lavorare
su una maggiore
quantità di microrganismi,
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perchè fino a che
sono mischiati
a tutta la matrice alimentare,
-
quindi devo avere
un sistema
che mi permette
di estrarli da li,
quindi prendo
un'aliquota dell'alimento,
faccio il campione,
e lo metto a crescere
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applicazioni
dei terre di coltura,
servono per
far crescere,
determinate specie microbiche,
per fare
un isolamento
in coltura pura,
-
io prelevo le singole
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-
-
-
microrganismi: crescita, metabolismo, sintesi
-
-
-
e sapendo le percentuale
con diversi costituenti
-
-
-
-
-
potassio, sodio, zolfo 3%
-
quindi quando,
si allestisce
un terreno di sviluppo
in laboratorio
questo è preparato,
mettendo una base
-
con diversi nutrienti,
in concentrazioni
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-
-
-
COLTURE PURE
ovvero è,
-
io vado a prelevare,
1, 2 ,3 colonie singolarmente,
-
-
in genere
questa operazione,
si fa su terreno solido,
perchè finché lavoro,
su terreno liquido.
-
e perchè qui
vedo un liquido
che diventa torbido,
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invece,
in terreno solido,
-
e soprattutto,
posso avere
queste colonie separate,
che posso poi
andare a separare,
anche singolarmente,
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isolamento colture pure,
-
-
-
-
inclusione per microaerofili,
-
-
-
-
-
-
CFU in campione solido
-
-
-
e poi io
alla fine della mia analisi,
-
quindi se il campione,
nasce liquido,
perchè è un succo,
io posso dire
in quel succo
ci sono 10 alla 8 CFU/ml
perchè si è contaminato tanto,
ma se era solida,
-
quindi una parte
messa in sospensione
con soluzione fisiologica,
-
quindi immagginiamo,
-
e faccio
tutti i conteggi,
e vedo
quante colonie ho,
faccio la conta dei CFU,
ed ottengo 1,59 x 10 alla 5 CFU/ml,
-
e qui ho,
1,59 x 10 alla 5 cfu in 0,5gr
-
quindi se,
in 0,5g ci sono 1,59 x 10 alla 5
e quindi
che in 0,5g ci sono 3,18 x 10 alla 5 cell/g
-
microscopio
e con formula,
-
e quello che conta
è che l'angolo
di penetrazione
della luce
nell'obbiettivo
è quello che determina,
il potere di risoluzione
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ovvero la capacità
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e permettermi di vedere,
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microscopio elettronico,
e visto che
a compiente energetica
aumenta,
quando la lunghezza d'onda,
-
-
ingrandisce molto di più,
-
-
-
-
microscopio ottico,
-
ed è fatto,
con obbiettivo ottico
che ingrandisce 10 volte,
-
e moltiplicando,
-
con quello dell'obbiettivo,
-
e di solito sono,
-
o campo scuro,
dove vi è
un condensatore,
che fa in modo
che solo
la luce riflessa
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-
ma la cosa imoortante,
è che con questo
microscopio,
arriviamo ad
una risoluzione,
che in cellule eucarioti
le vedo bene
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a volte anche
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ma in cellule batteriche,
posso vedere
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-
se voglio usare
i batteri al microscopio,
devo usare uno strumento,
-
-
procedimento MPN
-
-
poi bisogna avere
le tavole di McCrady,
ovvero tavole
-
elaborate,
sulla base di
una serie di
-
osservazioni precedenti,
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e questo grazie,
che le provette inoculate,
su mettono in coltura,
e dopo 24-48 ore,
(tempo per crescita),
tiro fuori le provette,
e devo vedere
- 1 more item...
poi man mano,
mi troverò in
una situazione
in cui i batteri
faticano a crescere,
-
quindi si va
verso situazione
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quindi io devo
vedere le provette
fino alla diluzione limite,
ovvero fino a dove
ho ancora
una crescita osservabile
in tutte le provette
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e il codice,
è formato:
la 1 cifra
è il numero di provette
che hanno una crescita
positiva
nella diluzione limite,
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-
quindi es)
test con 3 provette,
quindi 3 repliche per
ogni diluzione
quindi vediamo
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-
-
poi il codice,
lo vado a vedere
sulle tavole
(in questo caso
per le 3 repliche)
e abbiamo che
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-
-
preparazione campioni
a livello di laboratorio,
-
poi il campione solido
deve essere sospeso
in una soluzione fisiologica,
in una quantità definita,
ovvero dopo omogeneizzazione,
io prelevo una aliquota,
-
e poi la metto
in una soluzione fisdiologica,
si usa la soluzione fisiologica,
-
-
ma è possibile
conservare
un campione
ad una T° più bassa,
ma dipende anche
dal tipo di analisi
che si vuole fare,
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poi vi sono
vari passaggi,
magari una centrifugazione,
-
e poi si procede,
con un inoculo
del campione
su un terreno di coltura
microbiologico,
per vedere quali sono
i microrganismi
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-
HACCOP
(hazard analysis and critical control point,
-
e poi tutto quello
che viene dopo
il campionamento,
deve stare,
ad una serie di regole,
di studi di sicurezza
che vanno nell'insieme
delle norme
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-
-
-
e queste regole,
rientrano
-
nelle norme igieniche,
che sono poi
normative che
sono state sviluppate,
dall'organizzazione
internazionale
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ovvero,
se si dice che
nel campo della ristorazione,
bisogna procedere
in una determinata maniera,
vuol dire che
sono stati individuati
tutta una serie
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-
-
-
rilevamento batteriofagi
-
ma vi è il fatto che,
parliamo di modalità
di conta batterica,
attraverso semina
su piastra,
e questo mi permette
di andare a contare,
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-
nella conta
di batteri
vi è una precisa analogia,
tra conta unità formanti colonia,
e le unità formanti placca,
e visto che
vi è una specificità,
-
come tra virus e loro ospiti eucarioti,
-
e cioè sono tecniche
-
e a quel punto,
se rilevo
la presenza di
una infezione fagica
in quel batterio,
posso attribuirgli
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o definirli
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-
quindi,
i fagi solitamente
crescono all'interno
delle cellule,
che li possono ospitare,
ma una volta,
liberi da queste
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-
quindi i batteriofagi,
crescono nelle
cellule ospiti,
quindi è necessario
che nel terreno
di coltura solido,
ci metto anche i batteri
- 1 more item...
quindi
devo seminare
una sospensione di batteri,
in una piastra,
per cui quando preparo
terreno di coltura,
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-
quindi metto,
-
ma dove vi sono
i fagi su creano
dei buchi,
perché distruggono
il batterio
dove stava dentro,
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-
quindi le PFU,
sono le unità formati placca,
e anche queste
le posso misurare,
perchè se
-
-
-
e uso stessa formula
diluzione batterica
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-
IL CAMPIONAMENTO
e nel nostro caso:
in una matrice alimentare,
-
-
e cioè, se
un campionamento
è fatto male,
anche le analisi
che poi andremo a fare,
su questo campione
possono risultare falzate,
perché magari
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-
-
ma un conto,
-
e in quel caso,
uno va ad agire,
direttamente
-
su una persona,
e questo riguarda
soprattutto,
problematiche
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ma nel caso
un campionamento
in un ambiente naturale,
come quelli fatti
per vedere
microrganismi
-
-
o in una matrice alimentare,
-
cioè io se voglio
vedere se
c'è stata una contaminazione,
su un alimento conservato,
-
ma ne basta
- 1 more item...
e quindi devo agire
nel modo più opportuno,
in modo che poi
con quel campione
sia rappresentativo
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-
misura torbidità
lo spettrofotometro,
è uno strumento
che serve per indicare,
le variazioni
-
o nella trasmissione
della luce,
dovuto dal fatto
-
o soluzione
- 1 more item...
ma questa cosa
-
ma usato anche
-
quantità di
-
acidi nucleici,
e in questo caso,
quello che può cambiare è,
la lunghezza d'onda,
- 1 more item...
e nel caso di batteri
-
e quello che succede,
che quando misuro
la luce trasmessa
dalla cuvetta dopo
che è stata attraversata,
andiamo a misurare
- 2 more items...
quindi quando parliamo,
-
e misura allo spettrofotometro,
-
e il valorem che esce,
da questo strumento,
e questo OD (densità ottica),
-
-
-
fare queste verifiche,
per capire
quanti batteri ho
in un campione,
è banale
dopo che
uno sa usare
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ma per un determinato,
organismo,
ce io devo fare
per un po' di tempo letture,
per concentrazione salmonella,
-
e tutto ciò,
lo posso farlo,
facendo conta
su piastra
di quella coltura,
facendo prelievi
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quindi metto
batteri in coltura,
e vado a fare
che densità ottica hanno,
che dovrebbe essere
intorno a 0,
- 1 more item...
-
quindi
ogni ora, mi porendo
un campione
-
e densità ottica
e questo mi serve,
per sapere
- 1 more item...
ma poi se voglio misurare,
quant'è,
devo usare
uno spettrofotometro,
dove si ha
un sistema con
una lampada,
che emette luce
- 1 more item...
e questa luce
passa attraverso
un rcipiente,
detta cuvetta,
- 1 more item...
-
quindi se uno fa,
rapporto
tra intensità
luce I che è
- 1 more item...
rispetto I0
- 1 more item...
ma se nella cuvetta,
vi è una sospensione
con qualcosa,
che la rende torbida,
- 1 more item...
e questa cosa, viene usata
-
-
conta diretta,
vanno a misurare
il numero di microrganismi,
all'interno di un sistema,
-
si tratta quindi,
si tratta di un vetrino,
particolare,
in cui si mette
una goccia del campione,
che poi si mette
omogeneamente
lungo la superficie
- 1 more item...
-
e quindi quando,
vado a contare le cellule,
so già in che
volume si trovano,
e quindi poi
posso fare
una proporzione,
che mi dice
- 1 more item...
-
-
-
-
conta indiretta, conta su piastre
-
-
-
conta su piastra
-
-
-
-
e la preparazione
di queste piastre,
è stata fatta
tenendo conto
di un sistema,
che riguarda
il concetto di diluizione,
- 1 more item...
-
questa conta si fa,
preparando le piastre,
facendo un terreno,
-
e raffreddamento
(T° circa 70°),
viene versato
sulle piaste
- 1 more item...
poi le piaste si solidificano,
-
-
-
-
batteri
-
diversità
-
-
queste caratteristiche
che riguardano diversità
microbica,
a devo intendere
un qualche cosa
che mi permette
di andarli a caratterizzare,
- 1 more item...
diversità batterica,
benché siano
-
e invisibili,
la diversità tra batteri,
-
-
-
-
-
analisi su tutto genoma
-
-
altro metodo,
e questo diventa
il metodo di eccellenza,
-
-
e di solito si usa,
quando siamo
in presenza di microrganismo,
in cui abbiamo
difficoltà
- 1 more item...
qunidi,
si sono fatte delle
carratterizzazinoi,
si ha individuato la famiglia,
-
ma non si riesce
a capire,
- 2 more items...
e quindi questo
l'ultimo tentativo
che si fa
se io non so
se quel microrganismo, batterio,
- 1 more item...
e quindi faccio,
l'omologia DNA-DNA,
-
-
quindi possiamo immaginare,
-
e quello che si fa,
-
si fa una denaturazione
completa,
in modo che
2 filmanti,
- 1 more item...
-
-
e quando vado
denaturare,
avrò che
il DNA del mio,
si può riassociare
- 1 more item...
e quello che può succedere,
-
-
quindi se ho,
omologia sopra il 70%,
posso dire che
il mio microrganismo
appartiene alla specie
- 1 more item...
se è minore,
non appartiene
a questa specie,
e posso fare
- 1 more item...
ma se non trovo
- 1 more item...
-
-
-
analisi del microbioma
io qui
cultura indipendente,
-
posso fare amplificazione,
direttamente sul DNA,
per es, con PCR,
-
o solo per
delle porzioni
- 1 more item...
-
-
e qui quello che succede,
dall'amplificazione,
-
-
o comunque
un frammento
del gene per il 16S,
- 1 more item...
-
ma poi devo capire
e differenze,
quindi devo adottare
un sistema,
che mi permette
- 1 more item...
e non basta vederlo,
su gel elettroforesi,
perchè lì,
fanno un unico frammento
di amplificazione
- 1 more item...
-
-
-
gene 16S rRNA
è il gene presente
ella subunità,
più piccola del ribosoma,
-
-
-
-
e quindi andando
a confrontare il gene,
una volta fatta
a sequenza,
con quelli presenti
in una banca dati,
posso vedere
- 1 more item...
e quindi,
se vi è una omologia,
-
e quello
di specie note,
per oltre il 97%,
o posso dire
che il mio organismo
- 1 more item...
e oggi è il metodo
-
-
ma non basta,
perchè questo gene,
mi da una identificazione,
-
e poi comunque
è necessario,
a meno che poi
ella banca dati
non trovo che
l'omologia,
-
e una specie,
- 1 more item...
ma poi spesso
necessario,
fare altre analisi,
a nel momento in cui
so a che genere appartiene,
- 1 more item...
e quindi se so
che è un salmonella,
a quel punto ha senso,
che vado a fare,
i test con gli anticorpi,
ma se ho microrganismo,
che non so
ne se è
-
o Gram negativo,
o non faccio dei test,
così specifici
perchè non saprei
- 1 more item...
analisi gene amplificato
-
e anche il DNA,
come le proteine,
o fa correre
-
su una matrice,
he viene messa
a camminare
in un campo elettrico,
- 1 more item...
-
e a questo punto,
il DNA che ho ottenuto,
immaginiamo sia
quello per gene 16S,
e poi, questo gel,
o vado a colorare
con un colorante specifico,
- 1 more item...
-
-
-
ed io quindi,
a quel punto ho,
a sequenza di
un gene che misura,
1500 nucleotidi
-
e questi nucleotidi,
una volta che
- 1 more item...
PCR di un gene
quindi se io uso,
n sistema di PCR,
con primer che sono
dei pezzetti di DNA,
preparati
specificatamente per,
accoppiarsi
- 2 more items...
si fa con geni specifici,
primers
per un determinato gene,
e se questi primers
sono di tipo universale:
-
e questo,
che non può
- 1 more item...
o posso fare PCR
con primer specifici:
per un determinato gene,
- 1 more item...
