Congelación e infección de células
Congelación
Descongelación
Infección celular
Este proceso surge para minimizar los cambios genéticos que sufren las líneas celulares con los pases, evitar pérdida accidental o bien, la muerte de las células por contaminación.
Criopreservación
Proceso por el cual las células son congeladas a muy bajas temperaturas (-80°C hasta -196°C) con ayuda de nitrógeno líquido. Se recomienda con una confluencia del 80%.
Requiere el uso de crioprotectores, los cuales evitan que el proceso de congelación altere la estructura y función de la célula
Períodos críticos
1) Fase inicial de congelamiento
2) Retorno a temperatura ambiente
La membrana es la estructura que más se daña en el proceso debido a la pérdida de fluidez de lípidos.
Lesión crioinducida: por la formación de hielo o por estrés osmótico.
Penetrantes
No penetrantes
Son de bajo peso molecular y permeables a la membrana. Deshidratan para proteger de la formación de hielo a la célula.
Ejemplos: Glicerol, DMSO, alcoholes como el metanol.
De alto peso molecular. Son muy efectivos cuando se trabajan altas velocidades de congelación. Promueven la deshidratación desde el exterior de la célula. Se usan con penetrantes.
Ejemplos: Azúcares como la glucosa, manitol y sorbitol.
El DMSO es el más utilizado pero se caracteriza por ser tóxico para la célula: se recomienda hacer lavados lo más pronto posible en el retorno o usarse con soluciones glucosadas.
Métodos de criopreservación
Congelación y descongelación lentas.
Congelación lenta y descongelación rápida. Es la que tiene mejor tasa de supervivencia debido a que al descongelar rápidamente se evita la recristalización del agua.
Se lleva a cabo de manera rápida al sacar el contenedor de células del nitrógeno líquido y se introduce en un baño a 37°C. Las células se deben resuspender en medio para hacer lavados y diluir el DMSO y evitar que dañe a las células. Incluso después de los lavados, se recomienda cambiar de medio al día siguiente.
Único método para evidenciar el daño u efecto que tiene un virus.
Se suelen usar líneas continuas debido a que crecen indefinidamente, se mantienen relativamente fácil y son más resistentes.
Considerar que el tipo celular de elección debe ser susceptible a ese virus.
Se mezcla el medio de cultivo con el virus en concentraciones conocidas. Se incuba el tiempo de incubación especifico del virus. La evaluación se puede llevar a cabo hasta que el medio esté confluente al 100%. Se observa en microscopio invertido.
efecto citopático
Membrana o núcleos irregulares
Cuerpos de inclusión
Sincitios
Si no hay efecto citopático, se pueden usar otras técnicas que evidencien que el virus está ahí, como la hemaglutinación (si aplica), tinciones con anticuerpos monoclonales, etc.
