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Enzimas de Restricción/Polimorfismos
Enzimas de Restricción
Eficacia al usar enzimas
se debe tener en cuenta
Presentación comercial
Temperatura
Tiempo de incubación
Selección de enzima correcta
Corte en plásmido comercial
Corte en ADN genómico
Condiciones de almacenamiento y conservación
Se diluyen en glicerol
Temperatura: -20ºC
Aplicaciones
Ingeniería genética y clonación
Se realizan mapas de restricción
Se obtienen fragmentos por el corte de ADN por las enzimas para:
Clonación de vectores
Determinación de polimorfismos
Construcción de bibliotecas genómicas
Tipos de corte
Romos
La enzima corta ambas cadenas de ADN en forma lineal
Enzimas de corte: SspI, SmaI
Cohesivas
La enzima corta las cadenas de ADN en forma escalonada
Se producen extremos monocatenarios
compuesto de 3 a 5 bases
Enzimas de corte: EcoRI, BamHI, HindIII
Factores que evitan la Actividad de enzimas
Pureza del ADN.
Entre mas pura la muestra hay mejor trabajo enzimático
Contaminantes
Sales, detergentes y estabilizadores inhiben la actividad enzimática.
pH y temperatura
Su diferencia a los parámetros inhibe la actividad enzimática
Metilación del ADN
Las enzimas no funcionan en zonas metiladas
Patrones polimórficos
Se define como las diferencias genéticas heredadas entre individuos
Métodos para emplear polimorfismos de ADN
PCR: Permite amplificar regiones polimórficas y detecta fragmentos del material genético
Southern blot: detecta moléculas especificas de ADN repetias.
STR: Análisis específico en las pruebas de parentesco donde se comparan específicos loci, los cuales amplifican fragmentos que tienen secuencias cortas con repetición continua.
La electroforesis en gel: utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.
Los fragmentos de restricción polimorfica resultan de la variación en la secuencia de ADN que son reconocida por las enzimas de restricción .
Implantan un patrón genético el cual es aplicado en varios campos uno de ellos es la ciencia forense
Para la identificación de sospechosos mediante muestras de sangre, cabello, saliva o semen.
Permitiendo diferenciar los cromosomas de los individuos, y ayuda a establecer relaciones biológicas de parentesco.
Origen
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en investigación clínica
Las endonucleasas de restricción forman parte de la maquinaria con la que cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales.
Tipo ll
Gasto energético -
Específico en la secuencia diana
Sin actividad de metilasa
Tipo lll
Gasto energético ATP
Aleatorio 25 a 27 pares de bases corriendo abajo de la secuencia diana
Actividad de metilasa
Tipo l
Gasto energético ATP
Aleatorio fuera de la secuencia diana
Actividad de metilasa
Nomenclatura
Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se asigna según su origen bacteriano.
En números romanos, un numero para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie.
Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa.
La cepa o estirpe, si la hubiese
Tres letras en cursiva que corresponden al nombre científico de la bacteria de donde fue atraída. La primera letra, en mayúscula, corresponde al género; las otras dos, a la especie.
Ejemplos:
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.
R = cepa RV 13.
co = especie coli.
E = género Escherichia.
Eco RI:
III = tercera endonucleasa aislada en este organismo.
d = cepa DSM 11121.
in = especie infl uenzae.
H = genero Haemophilus.
Hind III:
Clasificación:
Tipo ll
Estas enzimas solo tienen actividad de restricción no de metilación y son las utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias específicas reconocidas. Requieren Mg2+ como cofactor y no requieren de ADN.
Tipo lll
Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana utilizando ATP.
Tipo l
Reconocen una secuencia específica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte además de necesitar ATP.
Polimorfismos
Secuencias variables de DNA debido a la disposición de pares de bases.
Formas moleculares
Bioquímico
: En proteínas o grupos sanguíneos
Identifican secuencias de aminoácidos
comparando
Cambios en proteínas de función enzimática
Propiedades fisicoquímicas
Cromosómico
: Morfología de los cromosomas
Fenotípico
: en un mismo individuo
Del DNA
: Diferencias en la secuencia nucleotídica
Clasificación por modificación del codón
Sinónimos/silentes
: No cambia el producto proteico
No sinónimos
: Traducción de un aminoácido por otro
Neutros
: Variación de bases en la región NO codificante
Clasificación de acuerdo a técnica y tamaño
SNP: de nucleótido único
Deleción, inserción o sustitución de una base
Muy frecuente
RFLP: Longitud de fragmentos de restricción
Uso de enzimas de restricción para recortar DNA
Electroforesis: homocigotos con 1 banda, heterocigotos con 2. Comparadas con una secuencia previamente conocida
VNTR: repeticiones continuas o en tándem
Microsatélites:
Secuencias cortas de DNA repetidas en bloque
Localizan polimorfismos en frecuencias no codificantes y así determinar la variabilidad de alelos
STR: Repeticiones cortas y continuas
Del cromosoma Y
Herencia paterna a hijos varones, con secuencias únicas que no hay en el cromosoma X
Uso de iniciadores específicos y microsatélites
InDel: Insertion-deletion
Polimorfismos por inserción o supresión de secuencias pequeñas
Suele darse un fenómeno de transposición: genes que se mueven a través del genoma y se reinsertan en lugares definidos en otra región
Marcadores mitocondriales
De herencia materna. Muy usado por la cantidad de DNA mitrocondrial
Identificar parentesco de individuos por línea materna.
RAPD: De secuencias aleatorias
Analiza polimorfismos sin necesidad de conocer previamente la secuencia
Electroforesis: Si hay homología las secuencias son amplificadas en una sola banda. Si no hay, no existe una banda.
Huella genética individual
: Herencia única de secuencia de alelos
Se expresan en la región promotora del gen
Inician en 1% de la población. Se van acumulando y generan una *divergencia genética
Mientras más alelos diferentes hay, más polimórfico es un organismo
Utilidad del análisis
Creación de perfiles genéticos para determinar el genotipo de un individuo y compararlo con marcadores genéticos ya analizados
Bioclínica
: Identificar un gen defetuoso que genere patologías específicas o el riesgo de generar uno
Biomedicina
: Identificar de forma temprana efectos secundarias de fármacos, medicamentos, incompatibilidad o resistencia a terapias.
Por ejemplo:
Se relaciona con:
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