Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Points de vigilance pour SMLM - Coggle Diagram
Points de vigilance pour SMLM
Système SMLM
Localiser un système accessible
Cartographie RTMFM
@
Liste des systèmes existants
NIKON = N-STORM
ONI
Leica = GSD
Zeiss = Elyra
Bruker = Vutara
Abbelight
Disponibilité / niveau de formation du référent
Lasers disponibles / puissance
Filtres
Correction des aberrations chromatiques
Possibilité 2D / 3D
Type illumination
@
EPI
signal sur bruit +
TIRF
signal sur bruit +++
HILO
signal sur bruit ++
Préparation d’échantillon
Epaisseur échantillon / Mode illumination
Distance entre plan à imager et lamelle < 200 nm = illumination TIRF, HILO ou EPI
Distance entre plan à imager et lamelle < 1 um = illumination HILO ou EPI
Distance entre plan à imager et lamelle jusqu'à 1 um et au delà = illumination EPI
:warning: Signal sur bruit croissant EPI-HILO-TIRF
Support culture cellulaire ou tissu
Surface verre épaisseur calibrée 1.5H
@
Surface verre lavée / dégraissée
@
Méthode de fixation
A adapter en fonction de la structure imagée, attention aux artéfacts
@
Nombre de co-marquage
2= difficile >3= difficile +++ en dSTORM
Possibilité de combiner STORM et PLAM sur échantillon fixé
Choix des fluorophores
@
dSTORM
AF647 +++
Multicouleur: attention au compromis (ex: composition Tp)
PALM
Taille et densité des structures à marquer
Attention à la problématique des évènements isolés au moment de l'acquisition (cf section acquisition)
Paramètres IF pour meilleur signal sur bruit
Optimiser solution de blocage (ajout NGS si AcII chez goat)
Augmenter conc Ac (sauf si structure dense et densité blink trop élevé)
Augmenter nbre et durée des lavages
Tampon
pH
pH 8 le plus fréquent
Chaque fluorophore a un pH optimal, si multi couleur il faut trouver le meilleur compromis.
Agents réducteur
Le plus utilisé=MEA
Gamme de concentration habituelle: 10-200 mM
Système désoxygénant
Glox
@
Dérivés commerciaux
Abbelight
@
Oxea
@
Milieu dégazé
@
Vectashield
@
Fiduciaires
@
Fiduciaires couramment utilisés
Tetraspeck 0,1 um T7279
@
Nouveaux fiduciaires
Nano diamond
Nanogold
Nanorod
Système de montage
Chambres
Ludin
@
Pecon
@
Adhésifs en silicone
@
Willco
@
@
Lame à dépression
Scellage avec Twinsil
@
Exemple de protocoles
@
Paramètres d’acquisition
Adéquation lasers / Fluorophores
Puissance laser
Le STORM nécessite des lasers puissants. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des lasers de 1 Watt. En cas de manque de puissance laser, problème pour faire passer les fluorophores à l'état triplet (off State). Les Blink ne sont pas assez individualisés et ne permettent pas un bonne résolution.
Mode acquisition multicouleur
Séquentiel
Acquisition 647 complète puis longueur d'onde décroissante
Nécessite l'usage de fiduciaires
Alterné
Intercaler séquences de chaque longueur d'onde
Nécessite des filtres multibandes
Evite l'utilisation de fiducaires
:warning: problème de blanchiment des fluorophores de longueurs d'onde plus élevées (ex: illumination 561 altère les fluorophores 647)
Temps d'exposition
A adapter en fonction de la durée des blinks
STORM: 10 à 50 ms
PALM 50-100 ms
Paint: 100 à 500 ms
Nombre de frame
2D
10000-20000
3D
env 50000
Paramètre à ajuster: Dépend de la dynamique des blink et de la densité des structures imagées
Critères bon / mauvais blink
Densité
Les évènements doivent être isolés
Si densité trop forte
Réduire conc Ac
Réduire temps exposition
Augmenter Conc en agent réducteur du tampon
Utiliser un algorithme de localisation spécial haute densité (ex: UNLOC)
Augmenter la puissance laser
Si densité trop faible
Augmenter conc Ac
Augmenter temps exposition
Diminuer Conc en agent réducteur du tampon
Utilisation laser 405 nm
Nombre de photons = SNR
Moduler la puissance laser
@
Utilisation laser 405
STORM: Permet de faire sortir les fluorophores de l'état Dark State
Traitement des données
Post traitements
Correction du drift
Cross-correlation
Fiducial correction
Tri des localisations
En fonction de la précision de localisation
En fonction de la densité des évènements
Reconnection / grouping
Pour reconnecter/regrouper les évènements à cheval sur plusieurs frames. Ces évènements gagnent ainsi en précision de localisation. Si un nombre important d'évènement sont concernés, le temps d'exposition pour l'acquisition peut être augmenté.
Modes de visualisation
Les données brutes obtenues sont sous forme de tableau de coordonnées. Il est possible d'obtenir une visualisation sous forme d'image avec différentes modalités de représentation des évènements (ex: Gaussian rendering) et de leur incertitude de localisation.
Softwares
Accès libre
Thunderstorm
@
UNLOC (algorithme permettant de traiter un blinking dense)
@
@
Deep learning
DECODE
Logiciels propriétaires
Abbelight = NEO
Elyra = Zen
NIKON = NIS
ONI = NimOS
Vutara = Bruker Srx
Quantification
Quoi et comment quantifier
1 couleur
Dispersions spatiales
Clusters
Densité
Taille
Plusieurs couleurs
Distance entre les localisations (contenues dans des clusters ou non)
Associations statistiques ou non de 2 nuages de points
Colocalisation / recouvrement de clusters
Softwares
SR Tesseler
@
applications
SODA
@
@
applications
Choix de la technique de SMLM
Disponibilité des fluorophores/sondes
@
@
Echantillon fixé
STORM
Ac fluo
PALM
Transfection prot fluo
Paint
Ligand fluo
Ac fluo
Ac-ADN (DNA paint)
Live / tracking
PALM
Transfection prot fluo
Paint
Ligand fluo
Ac fluo
Ac-ADN (DNA paint)
Choix de la technique de microscopie super résolution
Guide
@