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生化實 - Coggle Diagram

- - - - 使用儀器:UV Spectrophotometer
      - 原理:
        探測器測量儀器打出及穿過試品後的波長，
        計算吸光值，
        吸光值越大蛋白質濃度越大
      - Tryptophan、Tyrosine、Phenylalanine 帶有苯環，
        因此在 280 nm 時會有最大吸光值
        (Phenylalanine 的最大吸光值約在 260 nm，與 280 nm 接近，因此忽略而統一記為 280 nm)
      - DNA 在 260 nm 有最大吸光值，
        因此實驗室會測量試品在波長 280 nm 及 260 nm 的吸光值，
        以計算 DNA 的純度
      - 優點
        
        最簡易，無需加入其他化學藥劑，不會使蛋白質變性
        
        蛋白質間結合會導致構型改變而影響吸光值，
        因此可用來檢測蛋白質之間是否有結合能力
      - 缺點
        
        非常不敏感、不精準
        
        若蛋白質中 Phe、Tyr、Trp 含量極低，則反應會更加失準
    - - Biuret Reaction
        
        原理:
        蛋白質肽鍵中的 N-H 基團中的氮原子可和銅離子結合、
        並在鹼性環境下產生紫紅色的錯合物，
        並且在 540 nm 下會吸光，
        故可用來檢測蛋白質濃度
        
        吸光高峰值:540 nm
        
        試品顏色深淺與蛋白質濃度有關，蛋白質量越大者顏色越深
        
        此反應中不含 Biuret，
        只因最初是從 Biuret 發現此特性而命名:
        Biuret 由兩個尿素加熱後結合而成，
        科學家發現 Biuret 加入 Cu2+、鹼之後，
        Cu2+會與蛋白值骨架上的 N-H 基團結合，
        再被鹼還原成 Cu 而呈現紫紅色，
        而其反應的骨架類似蛋白質骨架，
        從而發現可用此方法檢測肽鍵
        
        優點
        
        因為是利用肽鍵，所以不受組成蛋白質的胺基酸種類所影響
        
        蛋白質數量越多則越靈敏
        
        缺點
        
        非常不敏感，蛋白質量需要到 100 μg 甚至毫克才能被檢測
        (單位濃度落在 5~160 mg/ml)
        
        反應需要銅離子，
        若試品中含有EDTA 等螯合劑則會干擾到實驗及結果
        
        反映需要4~8個小時才會褪色，耗時太久
      - Lowry Assay
        
        以 Biuret Reaction 為基準，
        但最後呈色時加入 Folin Reagent，
        使反應可較快完成(呈藍紫色)
        
        Folin Reagent
        
        氧化劑
        
        由磷鉬酸(Phosphomolybdic Acid)和磷鎢酸(Phosphotungstic Acid)組合而成
        
        藉 Tyr 和 Trp 的殘基還原這兩者，並產生藍色複合物
        
        可加入鉬藍(Molybdenum Blue)使呈色更明顯
        
        吸光高峰值:750 nm
        
        優點
        
        比 Biuret Reaction 更敏感，
        可測到更微量的蛋白質(0.01~1.0 mg/ml)
        
        蛋白質數量越多則越靈敏
        
        除了對 Tyr 和 Trp 有反應之外，也對 Cys 和 His 有少量反應
        
        缺點
        
        若待測蛋白質中 Tyr、Trp 含量極低，則反應會失準
        
        反應需要銅離子，
        若試品中含有EDTA等螯合劑會干擾到實驗及結果
        
        高鹽、酸都會干擾反應進行
        
        約1~2小時材會變色
      - BCA(Bicinchoninic Acid)Assay
        
        吸光高峰值:562 nm
        
        優點
        
        與 Biuret Reaction、Lowry Assay 相比，較不受干擾劑影響
        
        更精準，可測到更微量的蛋白質(0.5 μg/ml~1.5 mg/ml)
        
        呈色之後最穩定
        
        原理:
        和 Lowry assay 類似，
        以 Biuret Reaction 為基準，
        但在最後呈色時加入 BCA 使反應可快速完成，
        蛋白質將 Cu2+還原成 Cu+後，
        以 BCA 與 Cu+專一呈色來進行定量
        
        缺點
        
        反應需要銅離子，
        若試品中含有EDTA 等螯合劑則會干擾到實驗及結果
        
        約要半小時反應才會變色
        (仍耗時較久，目前約 5%的實驗室採用此方法)
      - Bradford Assay
        
        實驗原理:
        CBG 染料會與蛋白質結合
        (特別偏向跟鹼性或芳香族胺基酸結合)，
        並在吸收光譜上的 595 nm 處有最大吸收峰。
        蛋白質濃度越高則和 CBG 結合也越多，
        故在 595 nm 處吸光值也越高，
        故可以用來檢測蛋白質濃度
        
        吸光高峰值:595 nm
        
        優點
        
        最快速(目前約 90%以上的實驗室採用此方法)
        
        敏感性高
        
        與銅離子無關所以較不易受干擾素影響
        
        缺點
        
        蛋白質中疏水性、鹼性、芳香族胺基酸較少則容易失準
        
        不同種類蛋白質的反應差異很大，
        因此在選擇標準品時應選擇和待測物相似的蛋白質
        (如待測物為球型蛋白時，標準品也要選用球型蛋白)
  - - - 將溶液滴入 96 孔盤中時產生氣泡，在測量吸光值時會影響準確度
      - 96 孔盤受到汙染，如灰塵、底盤被手摸到等，皆會影響吸光值
      - 滴加溶液時溶液殘留在管壁上，且未使用離心機時，則會產生誤差
      - 標準曲線為各點近似值連成的一條直線，因此本來就有誤差存在
      - 使用 Micropipette 時液體殘留在 Tip 裡，
        導致真正參與實驗的溶液少於原本訂定的量，
        進而造成最終溶液比例有誤差
      - R2 值越高，代表各濃度與吸光值的相關性愈高，但不能代表兩者的準確度，因此可能發生 R2 值接近 1，但樣品吸光值換算出的濃度不合常理的情形
    - - 微量離心管底部的沉澱物會因振盪而上移，
        取 2 μl 至 96 孔盤時容易取到沉澱物，影響吸光值
      - 離心會使待測物的蛋白質沉降至微量離心管底部，
        造成整管溶液濃度不均勻