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Metodologias de sequenciamento, Sendo elas: - Coggle Diagram
Metodologias de sequenciamento
CRISPR/cas9
Várias aplicações
Saúde
Ciências farmacêuticas
Agronomia
Sendo esses associados especialmente às culturas de consumo direto
Alimenticias
Cosmética
Gerada em meados dos anos 80 por uma professora da Hannover Medical School
Metodo preciso
Bom custoXbeneficio
Alta eficiência
Benefícios de aplicação
do CRISPR
Reconhecimento de diferentes regiões do DNA;
Realização de diferentes tipos de cortes no DNA;
Identificação de atividade em diferentes temperaturas;
Maior facilidade de manipulação;
Aumento de especificidade para determinados organismos;
Oportunizar a descoberta de novos tipos de atividade.
Construção de biblioteca genômica
Para construir a biblioteca genômica através da metodologia CRISPR, algumas proteínas são utilizadas como "tesouras" moleculares
Cas9
Csf1
Cas3
Cas10
Cas12a
Uma única tesoura pode ter inúmeras aplicações
Podem ser agrupadas em bibliotecas destinadas como:
Filogenéticas
Estruturais
Funcionais
Combinação de marcadores celulares com características de interesse através de sequências nucleotídicas adaptadas às necessidades iniciais de aplicação do CRISPR.
Etapas:
Aquisição do espaçador
Transcrição do loco
Processamento do c-RNA para cada processador
cr-RNA + proteínas formando os complexos para geração de reação aos detectores de invasores
Detecta os nucleotídeos através da repartição individualizada e caracterizada. Após a detecção as células se preparam para atacar o mecanismo invasor
Mutagênese in vitro
Inserção de mutações definidas em diversas partes do sequenciamento do DNA
Construção de biblioteca genômica
Ativador de PCR
Quatro reações de PCR para que cada uma tenha deficiência para um nucleotideo específico
Exposição dos plasmídeos para análise
Identificação das mutações por luz UV
Os genes clonados são amplificados por PCR nos plasmídeos
A amplificação dos genes se dá pela utilização da prática de PCR
Mutagênese sitio-dirigida
Gerado através mutações específicas em uma molécula de DNA clonada através do acoplamento de oligonucleotídeos
Aplica-se primer de PCR para que ocorra a primeira mutagênese
Detecção dos nucleotídeos através da contra-prova para verificação dos DNA's gerados no processo e se condizem com os oligonucleotídeos aplicados no início do processo
Formação de biblioteca
Isola o DNA do plasmídeo da cepa
Adição dos iniciadores oligonucleotideos e anelamento
Extensão dos oligonucleotídeos
Realiza a PCR
Digestão dos produtos e corte nos sítios metilados
Transformações para verificação dos DNA's criados
Aplicações
anulação da função dos genes adotados ´por indução da mutação
Análise da estrutura-função das proteínas e ácidos nucleicos
Engenharia de proteínas
Sendo elas: