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Métodos Moleculares
Secuenciación
- INICIO: Lleva la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos.
- DESNATURALIZACIÓN: Se desnaturaliza el ADN , es decir, se separan las dos cadenas de las cuales está constituido. Este calentando (94-95 °C) la muestra.
- UNIÓN DEL CEBADOR: Éste se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos, generando así el alineamiento.
- EXTENCIÓN (72 °C ): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
- ELONGACIÓN FINAL: A una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. De este modo, se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
- CONSERVACIÓN: Se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.
Determina la secuencia completa de ADN en el genoma de una persona; consiste en determinar el orden de las bases Adenina, Citosina, Guanina y Timina en un fragmento de ADN.
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Microarreglos
Los microarreglos de DNA, son aplicados para la información obtenida de la secuenciación sistemática de los genomas completos.
Considerados de gran utilidad e importancia por la cantidad de secuencias de genes que puede analizar por pruebas.
Se fundamentan en la hibridación de ácidos nucleicos por la unión de dos cadenas complementarias de DNA para moldear una doble cadena.
Esta técnica genera los Chips de DNA, mismos que son son una grande cantidad de puntos de ADN que se enlazan a una superficie de cristal, sílice o plástico. Estos puntos poseen una cantidad de DNA específico que hibrida una secuencia de un gen de interés y puede ser detectado a través de moléculas de fluoróformo.
La lectura de este tipo de hibridación se realiza mediante un sistema de software diseñado específicamente para analizar la información obtenida de los microarreglos.
Esta técnica ,emplea los siguientes colores: rojo y verde, donde el color rojo indica los niveles de concentración, el verde identifica al control, mientras que las coloraciones: verde-amarillo muestran una expresión disminuida y las coloraciones rojo-naranja indican expresión aumentada.
PCR-Tiempo real
Se centra en la fase exponencial porque proporciona los datos más precisos y exactos para la cuantificación.
FUNDAMENTO
Mediante el uso de reporteros fluorescentes, permite detectar y cuantificar en tiempo real secuencias especificas de ácidos nucleicos
PCR-Multiplex
Es el proceso el cual permite la amplificación de varias secuencias Dianas, permitiendo la identificación de distintos genes simultáneamente.
FUNDAMENTO
La PCR-multiplex utiliza el mismo sistema de la PCR convencional, pero con la diferencia que se puede amplificar dos o más locUD, utilizando una misma mezcla de reactivos pero cada región objetivo tiene su propio juego de cebadores, lo cual ahorría más tiempo para la amplificación de diferentes secuencias de DNA.
PCR-Anidada
Está destinada para realizar una segunda amplificación empleando el primer producto de amplificación como molde
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Emplea dos parejas de primers, una externa y otra interna a la primera. La sensibilidad de la PCR aninada es extremadamente alta, debido al proceso de amplificación dual
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Fundamento
Reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia de ADN durante varios ciclos repetidos
Se lleva a cabo en tres etapas: Desnaturalización, hibridación y extensión
Los elementos importantes en la reacción son:
templado o molde (ADN o ADNc), Taq polimerasa, primers, dNTPs, (Mg +), buffer y H2O
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BIBLIOGRAFÍA
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ºMurrieta, M & Valenzuela, J. (2007). MICROARREGLOS DE ADN: APLICACIONES EN LA MICROBIOLOGÍA. DESDE LA ACADEMIA. Disponible en: https://epistemus.unison.mx/index.php/epistemus/article/download/95/69/147ºPerera, C., & Acevedo, A. (2018). Nuevas tendencias en el diagnóstico de enfermedades virales en los animales. Revista de salud animal, 40(3), 7–8. http://scielo.sld.cu/pdf/rsa/v40n3/2224-4700-rsa-40-03-e02.pdfºAnalytical Biotech. (2012, 31 julio). PCR anidada. Recuperado 26 de octubre de 2021, de https://analyticalbiotech.wordpress.com/pcr-anidada/
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