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Séquençage Nouvelle Génération I = NGS - Coggle Diagram
Séquençage Nouvelle Génération I = NGS
Intro
NGS : séquençage haut débit
Permet d'avoir accès au transcriptome, métagénome et petits fragments ainsi que liaison à ADN, génome ...
2 grandes proprios au séquençage haut début : séquençage massif & grande sensi = détection d'évent rares
Diff avec
séquençage Sanger
(1e génération) : analyse 1 petit fragment de ~500pb contre 6 milliards de fragments de ~300pb pour NGS donc couvre toute la région de la séq & lecture non globale mais individuelle donc mut° détectée (pas forcément pour Sanger)
Process d'analyse de l'échantillon : 1) constitution d'une librairie 2) Amplif des fragments clonaux 3) séquençage 4) analyse bioinfo 5) analyse expérimentateur → résultats
Préparation librairie
Varie avec application et kit utilisé mais aboutit tjrs à la même étape : banque de fragments ADNdb
Whole genome
: 1) fragment° aléatoire d'ADNg par sonication, enzyme, transposase ou nucléase → ~200pb et amplif en même temps = ajout aux extrémités des mêmes séq adaptatrice (ligation) 2) purif et selection taille 3) PCR
Enrichissement par capture
: comme whole genome avec sélection de séq d'interet par sonde complémentaire (biotine) récup par billes magnétiques (streptavidine)
Stratégie amplicon
: 1) N amplicons de PCR : amorces spé aux extensions communes à l'ensemble des amplicons 2) 2e PCR avec un seul couple d'amorce (→ + econome)
Amplif en cluster
c-bot
→ ex :
Illumina
Illumina : séquençage par synthèse utilisant nt termineur de séq fluo réversible
Amplif en cluster c-bot = support où sont attachés primers =
flow cell
1) Hybridation 2) Extension 3) Dénaturation : copie du fragment reste avec primer 4) Formation ponts 5) Clivage pour garder même sens du fragment 6) Séquençage
Restriction spatiale d'un clone sur flow cell et dilution adéquate des fragments issus de la librairie sur la flow cell
Analyses bioinfo
Analyse image → analyse base → démultiplexage → alignement : avec un génome de reference → variant calling : si analyse d'un variant cible → analyse des variants : gène impliqué, mut°, exon ou intron, présent ou non dans base de données
Qscore pour Illumina = 30 et proba d'erreur à 0,001
II nde génération
Technologie ROCHE
avant Illumina : amplif clonale sur des billes = PCR émulsion (gouttelette lipidique)
Technologie des semi conducteurs (ion torrent)
: libération H+ → variation de pH qui emet un signal
Technologie Life
: émulsion sur puce
Nouvelle génération (IIIe)
Inconv de IInde génération : amplif obligatoire ce qui genere erreurs ; reads courts (2x300pb) ; temps long ; coûteux
3e génération : base sur brin unique non amplifié → + vite + long - cher & astuce de créer boucle entre sens et anti pour lire les 2 et diminuer erreurs
PacBio : technologie SMRT
: séquençage en temps rél par fluo → 200kb mais moins précis (85-90% contre 99,9% pour Illumina) →
mode de lecture HiFi
= haut fidélité → relecture pour augmenter précision
Oxford nanopore
: séquenceur utilisant nanopore. Mb isolante avec pores formés par prot laissant passer mol et ions → créent potentiel de mb → perturbation du flux ionique enregistré
Electron-based read out
: peut lire en temps réel la modif des bases (méthyl° des C)
Séquenceur de poche
: 2Mb avec 450b/s (testé pour Ebola ou sur station spatiale)
Applications : DNA Séq, RNA Séq, ChIP Séq, (loca fix° prot sur ADN et ARN), méthyl Séq
