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Introducción a cultivo celular - Coggle Diagram
Introducción a cultivo celular
1)Limpieza y desinfección
Limpiar equipo con extrán al 25%, retirar con un paño húmedo y terminar de limpiar con alcohol al 70%
Encender luz UV por 10 minutos
Calentar el termobaño a 56ºC
2)Preparación del material de trabajo
Lavar le material que se necesite
Si no se cuentan con pipetas serológicas deben lavarse perfectamente y colocar algodón en la boquilla superior, cuidando que no quede compactado, posteriormente flamear con el mechero las boquillas para eliminar el exceso de algodón, colocar en un pipetero y esterilizar por calor húmedo
Colocar manitas en una caja petri de vidrio y esterilizar
5) Preparación de solución de glutamine 300 mM
En un tubo cónico de 50mL, pesar glutamina para preparar 20mL de solución a concentración de 300mM
Lleve a la campana el tubo y disuelva la glutamina en 20mL de DMEM
Filtrar la solución colocando el perreado en un tubo falcon de 50mL estéril
Realizar alícuotas de 1.5mL en tubos eppendorf estériles
6) Suplementación del medio de cultivo
En la campana exclusiva para suplementar medio de cultivo colocar en gradilla las alícuotas de soluciones indicadas
Suplementar 45 mL de medio de cultivo Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM)
Adicionar
Suero fetal bovino 10%
L-glutamina 2mM
Penicilina-estreptomicina 100uL en 100mL
Filtrar y colocar el medio en un tubo falcon de 50mL estéril
Etiquetas y guardar a 4ºC
suplementar y agitar para mezclar homogéneamente
4) Preparación de Buffer de fosfatos (PBS)
Preparar 1L de buffer de fosfatos 0.1M pH 7.4
Preparar 60 mL de solución 1M de Na2HPO4
Preparar 45 mL de solución 1M de NaH2PO4
Tomar 57.7 mL de Na2HPO4 y 42.3mL de NaH2PO4
aforar a 1 L, ajustar el pH a 7.4
Dosificar entre equipos
5.4 g en 45mL de agua destilada
8.52 g en 60 mL de agua destilada
3)Inactivación del suero fetal bovino
Colocar suero fetal bovino en el termobaño (56ºC) por 30 minutos
Ajustar termobaño a 37ºC
Limpiar todo material de trabajo que se usara dentro de la campana con alcohol al 70%
Alícuotar todo el suero en tubos Corning estériles de 50 mL correctamente etiquetados
Sellar las boquillas con parafilm
Tomar una alícuota y separa el volumen entre el número de equipos del grupo, es resto conservar a -20ºC
7) Transferencia de fluidos y pipeteo
Se proporcionaran 2 frascos T-25 cuyo peso deberá registrar cada vez antes de verter más líquido
Llevar frascos a la campana y verter en la pipeta indicada de 2mL de PBS al frasco
Registrar tiempo que se tarda en realizar el pipeteo y el peso del frasco antes y después de verter el líquido
Finalmente colocaran 5mL del medio de cultivo en un tubo falcón de 15mL, lo cerraran y lo incubaran por 4 días
A los 4 días revisar tubo para registrar cualquier evidencia de contaminación
Deshechar tubo
Calcular porcentaje de contaminación
Comparar resultados